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【关键词】 影响酶联免疫吸附试验 原因分析 应对措施
酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测生物标本中微量的特异性抗体或抗原的一种临床检验方法。因其操作简单，灵敏度高，特异性好，达纳克水平，经济安全，不需要特殊设备等特点而在临床医学检验中得到广泛应用。但是，在检验的实际操作过程中，由于各种客观和主观因素的影响，可能对检测结果产生误(漏)诊，直接影响临床医师正确诊断患者所患疾病和对患者病情的判断。为此，本文对ELISA试验操作的各个环节中容易出现的问题和注意事项进行了如下总结，以提高临床检验质量。
1试剂的准备
目前各种ELISA试验均有商品化的专用试剂盒。应选择质量优良、有批准文号且在有效期内的检测试剂，严格按照试剂说明书进行实际操作。从冰箱中取出的试剂应放在室温下或37℃平衡30min再进行测试。保存试剂盒的冰箱应经常检查储存温度并做好记录，冰箱应避免频繁开关。试剂使用前应摇匀。
2标本的采集和保存
ELISA试验所用标本主要为血清，也可以用经过预处理的唾液、尿液、粪便等生物材料。患者标本可能含有干扰试验的免疫物质，导致假阳性或者假阴性的结果，干扰因素一般可分为两类，即内源性和外源性干扰因素。内源性干扰因素包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白等，避免内源性干扰因素主要通过选择合理的试剂。外源性干扰因素包括标本溶血、标本被细菌污染、储存时间过长及标本凝固等。在血液采集和运输过程时，应注意避免溶血[1]。否则，红细胞溶解时会释放出血红蛋白，血红蛋白中的亚铁血红素具有过氧化物酶活性的物质，在以HRP为标记的ELISA试验测定中，可能会增加非特异性显色而出现假阳性结果。血清标本适宜在新鲜时检测，若推迟检测需将标本低温保存。一般说来，在7天内检测的血清标本，可放置于2℃~8℃保存，超过1周检测的需低温冰存。因反复冰融会使抗体效价降低，所以，对需要保存做多次抗体测定的血清标本，应少量分装并冰存。血清标本应充分离心，否则可因残留的纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。
3加样在ELISA试验
操作中，依次有3次加样，即加标本、加酶结合物、加底物。加标本一般采用手工加样或者加样器。手工加样每次必须更换吸嘴，以避免交叉感染。要掌握好并在实际操作中揣摩使用技巧，避免吸样量过多或过少。加样器在长时间使用时会因机械磨损或推动杆内附着的血痂等原因造成加样不准，因此必须定期对加样器进行维护和校准。加酶结合物和底物一般可直接滴加。每次加样时，应将所加物置于ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，注意不可溅出，不能产生气泡，加酶试剂后要用吸水纸在酶标板上轻轻擦拭吸干。加底物操作时应注意各试剂盒显色剂不能混用，添加顺序不能颠倒，不能溅出孔外。标本较多时，需要分批操作，以免加样板过多，造成加样后放入孵箱前等待时间过长(尤其是在室温较高时)。最后，在微型振荡器上震荡lmin，以保证混匀。
4温育
ELISA反应是抗原、抗体的结合在固相表面上发生的一系列的反应，抗原抗体结合是一个逐步平衡的过程，需要经过扩散才能达到反应的终点，因此ELISA反应需要一定时间的温育。温育也是影响检测结果的关键因素，尤其是对弱阳性标本影响最为明显[2]。温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好地解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异(即“边缘效应”)。温育常采用的温度是43℃、37℃、室温和4℃，其中最常用的是37℃，也是大多数抗原抗体反应的适合温度。为了保证各板的温度能迅速平衡，可将反应板放在水浴箱中，漂浮在水面上，但反应板不应叠放。为避免标本或稀释液蒸发而吸附于孔壁，反应板应加盖或贴封纸。注意温育的温度和时间，应按规定力求准确无误。因为孵育时间过长，可以出现非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底，导致花板。
5洗涤
洗涤是ELISA不同于均相免疫学检测技术的一大特征，洗涤在整个ELISA反应过程虽不是一个反应步骤却非常关键。操作者应严格按照要求洗涤，因为ELISA试验就是依靠洗涤来达到分离游离的酶标记物和结合的酶标记物的目的。通过洗涤，可以清除残留在板孔中没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。采用自动洗板机洗板，洗板机设置时间、间隔、次数要保持一致，不能过多或过少。洗板次数较少，造成残留，引起假阳性结果。洗板次数过多，可造成抗原抗体结合物洗脱，造成假阴性结果[3]。要保证洗液注满各孔，防止在反应孔中形成气泡而造成洗涤不充分。洗板结束后，最好在干净无尘的吸水纸上轻轻拍干。如洗液量不足可致洗板不彻底，洗板针堵塞，抽吸不完全，洗板不畅，导致洗板效果差。
6显色
显色是ELISA试验中最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。适当提高温度，有助于加速显色。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。在定量检测中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。ELISA显色结果最好通过酶标仪进行，可减少实验误差，提高临界值样本的分析准确度。尽量避免肉眼直接判断结果，因为不同个体的视觉存在差异。应注意，加显色剂时，要保持显色剂不外流。加终止液时应避免产生较多气泡，否则可能使假阳性结果的出现概率增加。
7比色
比色的方法有目视法和酶标比色法2种。目视法简单明了，但对同一标本，操作者的不同有时会出现不同的结果，具有一定的主观性。比色的结果通常用光密度表达，现按规定用吸光度表达。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时的适宜室温在15℃~30℃之间，使用前要先预热仪器15~30min，使测得结果更为准确。比色前，应先用洁净的吸水纸擦拭干净板底附着的液体，然后将板正确放在酶标比色仪的比色架上。综上所述，优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。在实际应用过程中，操作者必须熟练掌握基本操作技能，对每个环节进行严格仔细的核查，尽量避免假阳性和假阴性反应的出现，保证检测结果真实可靠，为临床诊断和疾病防治提供可靠的理论依据。
【参考文献】
1孙鑫，陈彦，张继瑜，等.不同程度溶血对ELISA法检测血清HBVM的影响.世界感染杂志，2004，4(2)：174-176.
2徐锡霞，邓巍. 温育条件对ELISA定性测定HBsAg结果的影响.实用肝病杂志，2005，8(1)：16-18.
3刘祖勇. 增加洗板次数对HBsAg ELISA检测影响.中国输血杂志，2006，19(2)：135-136.