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【摘要】 目的观察基底膜蛋白多糖功能区I(PlnDI)重组支架在小鼠体内的促血管生成情况，评价其促血管生成效果。方法分处理组和对照组，以聚乳酸(OPLA)支架为载体，OPLA+PlnDI为处理组;对照组：OPLA无处理。选取6只雄性小鼠分为6组，4种支架分别植入每只小鼠四肢与背部交接处，1、2、3、4、6、8周取材，进行HE染色和免疫组织化学染色，观察重组PlnDI促血管生成效果,显微镜下计算微血管密度(MVD)，Tukey检验法进行定量分析,比较其MVD的差异。结果1～8周内随时间延长，支架与周围组织融合良好，移植物周围血管逐渐增多，并有肉眼可见的血管长入;8周时最为明显，可看到大量微细血管长入;同时OPLA支架随时间延长逐渐降解，支架内部被组织分割成小区域并伴随有血管长入。MVD显示，1周时处理组与对照组比较已经差异有统计学意义(3.30±0.42比1.80±0.29);3周时是OPLA组的近3倍(11.70±0.87比4.50±0.34);8周时处理组的MVD仍是对照组的3倍多(31.40±1.35比9.90±0.67)。结论在小鼠体内，基底膜蛋白多糖功能区I(PlnDI)具有良好促血管生成作用。
【关键词】 基底膜蛋白多糖功能区I(PlnDI);血管生成;微血管密度;聚乳酸支架
【Abstract】ObjectiveTo observe the distribution of Perlecan domain I(PlnDI)for echancing mice angiogensis at different time point.MethodsOpen cell lattice acid scaffold(OPLA) covered with Pln DI was experiment group.The contrast group was OPLA without any treatment.All those scaffolds were implanted in subcutaneous tissues at junction between limps and back of mice.After 1，2，3，4，6，8 weeks，scaffolds were explanted and seperaterly stained with HE and immunocytochemistry.Calculat microvessel density(MVD) under microscope and analyses their differences in Turky-test.ResultsFrom 1 week to 8 weeks，OPLAs expressed good biocompatibility，there were more and more microvessels surronding and getting into implanted OPLAs，visible vessels were observed in experiment group especially at 8 weeks.The experiment group is higher than the contrast group even at 1 week(3.30±0.42 to 1.80±0.29).At 3 weeks，the experiment group is 2.6 times than the contrast group(11.70±0.87 to 4.50±0.34).Until 8 weeks，MVD of the experiment group and the contrast group is separately 31.40±1.35 and 9.90±0.67.ConclusionPlnDI expressed good echancing angiogensis ability in mice.
【Key words】Perlecan domain I(PlnDI); Angiogensis; Microvessel density; open-cell polylatice acid scaffold
基底膜蛋白多糖(Perlecan)广泛存在于细胞膜表面和细胞基质中[1,2]，与多种因子交互作用从而参与机体的许多生理过程。基底膜蛋白多糖蛋白核心结构分为五个功能区，区域I最独特，含有三条硫酸乙酰肝素链，硫酸乙酰肝素链是基底膜蛋白多糖蛋白核发挥作用的一个特异性因素。基底膜蛋白多糖参与血管生成主要是通过功能区I与血管内皮生长因子结合来实现的[3]。本实验以复合支架为载体将提纯的基底膜蛋白多糖功能区I(PlnDI)作用于小鼠体内，构建血管生成动物模型，模拟血管生成环境，观察促血管生成情况，以评价PlnDI重组促血管生成材料在小鼠体内的效果。
1材料与方法
1.1材料清洁级雄性昆明小鼠6只，6周龄，体质量30~35g，由第四军医大学动物实验中心提供,许可证号SCXK(军)2007-007。OPLA 支架(BD公司,USA)，基底膜蛋白多糖功能区I(PlnDI，由本课题组实验室层析法提纯)[4]，小鼠来源的CD31抗体(BD公司，USA)，DAB显色剂(北京中山生物技术公司)。
1.2方法
1.2.1分组对照组：OPLA组(OPLA支架无任何处理)。处理组：在OPLA支架上形成基底膜蛋白多糖涂层：PBS液稀释PlnDI到20 μg/ml，将OPLA支架浸泡于PlnDI溶液中，无菌条件室温下放置4h， PBS液漂洗，立即放入无菌试剂盒中冷冻干燥24～48h， 4℃条件下无菌保存。
1.2.2动物模型的建立将小鼠分为6组，每组1只，按10g/L戊巴比妥(40～60mg/kg)腹腔注射，麻醉后固定于手术台上，剪去背部毛发，碘伏消毒，酒精脱碘;沿背部中轴线做切口，游离、扩张皮肤与皮下组织，使背部与前肢交界处分离，在小鼠背部与前肢交接处植入处理好的2种支架，缝合切口;在1、2、3、4、6、8周时随机选取1只，处死，沿背部中轴线做切口，游离、扩张皮肤，充分暴露四肢支架植入部位，钝性分离支架，取出，脱水，石蜡包埋，切成5μm厚组织片。
1.2.3HE染色10%甲醛固定组织片30min;蒸馏水洗1次后，浸入苏木精染液5～10min，浸入0.5%盐酸-70%乙醇溶液30～60s;浸入碱性溶液碱化;蒸馏水洗1min;置伊红溶液中30～60s;梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，各5min;中性树胶封片。封片后在光学显微镜下观察并照相。
1.2.4免疫组织化学染色组织切片脱蜡;高压修复;流水冲洗5min，画蜡圈后PBS液洗3遍;3%双氧水处理15min;用PBS液洗3遍，加羊血清37℃恒温箱孵育30min;加小鼠来源的抗CD31抗体，37℃恒温箱孵育2h;PBS液洗3遍，通用二抗37℃恒温箱孵育40min;PBS液洗3遍，DAB显色;苏木精衬染，脱水，透明，封片。光学显微镜下观察并照相。
1.2.5微血管密度(microvessel density，MVD)测定按照Weidner[6]标准在低倍镜视野下(×100)选取微血管比较丰富的区域，再在×200视野范围(0.74mm 2 /视野)下进行微血管计数，每例标本分别计数10个视野，取其平均值作为MVD值。
1.3统计学分析使用SPSS13.0软件，采用独立样本t检验法进行统计学分析，比较每个时间点两组血管生成数量，实验结果以〖x〗±s表示， P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1试验小鼠肉眼观察大体情况可见小鼠活动自如，精神正常，饮食状况良好，皮肤切口愈合良好，无开裂、无炎症、无溃烂，触摸植入部位皮温正常、皮肤表面无异常，移植物无位移，表面稍隆起，表面光滑，轻触移植物无滑动(图1)。
2.2肉眼观察取出的支架随着时间延长，支架原有形态逐渐消失，支架均发生降解，与周围组织融合逐渐紧密。1周时：支架保持植入前形态，吸收较少，但与周围组织无排斥现象。2周时：圆柱形支架边缘有所吸收，支架变得圆钝，与周围组织分离较困难。3周时：支架原有形态已看不到，与周围组织融合良好。4周时：支架明显变薄，支架表面与周围组织同化。6周时：支架质地变软，原有形态完全消失，类似周围组织，有明显血管长入。8周时：支架变得很薄，与周围组织融合紧密，血管长入明显。
2.3HE染色观察取出的支架可以看到随时间延长复合支架血管长入逐渐增多，管径增大，管壁增厚，血管更加成熟，血管伴随组织逐渐深入支架内部。第1周:仅在支架边缘可以看到血管，看到的血管数量较少，管径较细，管壁较薄;第2周:支架边缘血管管径有所增大，管壁有所增厚，支架边缘内部可以看到较细微的血管;第3周:支架边缘和内部血管数量增多，有的管径较大较成熟，有的管径较小，管壁较薄;第4周:血管长入逐渐加深，支架内部可以看到数量较多的血管，但管径很细小;第6周:组织伴随血管逐渐长入支架内部，支架吸收明显，组织所占比例增多，内部血管数量进一步增多;第8周:组织几乎完全占据支架，支架残余很少，组织内部血管数量较多，管径较大，管壁较厚，更加成熟，长入的组织血供良好。
2.4免疫染色结果见图2、图3。CD31作为血管内皮细胞标记物，免疫组织化学染色可以更清楚地看到血管壁情况，便于对重组支架促血管生成量的微血管密度进行定量分析。
2.5微血管密度(MVD)测定结果与统计结果如图4。
3讨论
基底膜蛋白多糖(Perlecan，也称串珠素)是细胞外基质中硫酸肝素类蛋白聚糖之一，由核心蛋白和4条硫酸肝素侧链组成， 鼠类分子量约为700kD，其核心蛋白含5个功能区(如图5)，第一功能区即基底膜蛋白多糖功能区I(PlnDI)分子量约 390kD，附着有3条长的HS侧链。已经证实，膜蛋白多糖参与细胞增殖、 脂蛋白摄取、 细胞黏附和 ECM组装， 在调节血管生物学行为和损伤修复中具有重要作用;最新研究发现参与血管生成的调节， 其在新生血管形成与功能完善中的作用开始受到关注。基底膜蛋白多糖参与血管生成主要靠它的硫酸乙酰肝素链与血管生成因子的特异性结合实现的[3]。PlnDI是以血管基底膜蛋白(BM-40)为前导序列，插入PlnDI的cDNA编码(第22-194氨基酸)构建质粒载体转染293 EBNA细胞，从条件培养基获取高效表达的重组PlnDI(1.2mg/L)[4]。研究显示，重组PlnDI与FGF-2和VEGF165有很强的亲和力;能促进血管内皮细胞和成纤维细胞的增生。CasPer 和Yang 等[5]发现，I 型胶原三螺旋单体在形成胶原纤维过程中与重组PlnDI在生理条件下自动结合，以自组装的方式形成PlnDI/I 型胶原复合基质，其原理是两个大分子的结构中存在内在的结合机制，引发非共价的结合反应;但相关血管生成研究结果未在实验动物中验证。聚乳酸(polylactic acid，PLA)因其良好的生物相容性和可降解性[7，8]，是目前最常采用的构建促血管发生的支架材料。OPLA支架是由D，D-L，L聚乳酸形成的复合支架，吸附性能更好，三维多孔结构更加致密，有利于各种生长因子和细胞的黏附、迁移、增殖，有利于营养物质的运输传递和支架的血管化发生[9]，因此我们根据CasPer 和Yang 等的方法，采用OPLA支架和重组PlnDI相结合的方法，形成新型自组装血管发生材料，充分发挥各自的性能优势，以促进血管生成。本动物实验研究显示，对照组与处理组随时间延长微血管密度均增加，但增加趋势不同。1周时处理组的微血管密度虽然高于对照组，但无统计学差异;从第2周开始，处理组微血管密度与对照组有统计学差异，随时间延长，两组的差异逐渐增大，对照组增速缓慢，说明构建的PlnDI复合支架在小鼠体内可以很有效地促进血管生成。试验小鼠肉眼观察大体情况显示，植入本研究材料无排异反应;HE染色观察显示随着时间延长，支架原有形态逐渐消失，支架均发生降解，与周围组织融合逐渐紧密;表明本研究构建的PlnDI复合支架材料在小鼠体内有良好的生物相容性,为后续应用研究奠定了实验基础，也将进一步研究重组PlnDI与FGF-2和VEGF165在动物体内的血管生成情况。
4小结
本实验对PlnDI复合支架的促血管生成效果进行定性定量分析，为促血管材料的应用提供了准确的实验依据。证实PlnDI以OPLA支架为载体，在小鼠体内具有良好促血管生成作用，是一种良好的促血管生成材料。(本文图片见封三)
【参考文献】
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4Daniel D.Carson，Mary C.Farach-Carson，Weidong Yang.Compositions and Methods for Repair of Tissues.US20090162436.06/25/2009.
5Casper CL，Yang W，Farach-Carson MC，et al.Coating electrospun collagen and gelatin fibers with perlecan domain I for increased growth factor binding.Biomacromolecules,2007,8(4):1116-1123.Epub 2007 Feb 28.
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