人工假体周围骨溶解的基因治疗研究进展

　　虽然全髋置换术是临床上治疗严重髋关节疾病的有效手术方法，但术后出现的人工假体周围骨溶解引起假体无菌性松动仍然是影响人工假体使用寿命的主要原因之一。过去许多研究表明在磨损颗粒刺激下可以激活破骨细胞，诱导骨重吸收。目前人工假体周围骨溶解还不能通过非手术治疗得到很好的预防和治疗，必须进行全髋关节翻修手术治疗。随着分子生物学的发展，越来越多的科学工作者从不同的角度对人工假体周围骨溶解进一步深入地研究，尤其是基因治疗方面的研究。基因治疗作为近年来兴起的一种治疗方法，可在分子水平进行调控，从而为延缓或逆转疾病进程提供了新的可能性。本文就目前人工假体周围骨溶解的基因治疗的研究现状及进展进行综述。

    1  与磨损颗粒诱导骨溶解有关的细胞因子

    目前认为假体周围骨溶解引起人工假体无菌性松动是由于磨损颗粒积聚达到一定浓度后刺激人工假体周围的组织巨噬细胞表达细胞因子，如白介素1（IL1β）、白介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNFα）、骨保护素配体（OPGL）或称为核因子KB受体激动剂配体（RANKL）等细胞因子〔1〕。大量体内和体外实验均表明，TNFα和IL1β对于破骨细胞的前体的聚集和分化为成熟的破骨细胞起着重要的作用。在TNFα、IL1β作用下形成表达核因子κB受体激动剂（RANK）的巨噬细胞，然后在成骨／基质细胞产生的巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）和RANKL协同刺激下形成成熟的破骨细胞，也就是说在假体周围组织中有一部分巨噬细胞的前体细胞可以分化为具有骨重吸收功能的破骨细胞〔2、3〕，在界膜磨损颗粒异物反应中，RANKL阳性的成纤维细胞可以替代成骨细胞，与RANK阳性的巨噬细胞相互作用。RANKL阳性成纤维细胞／成骨细胞和RANK阳性的单核/巨噬细胞之间的接触使巨噬细胞的前体细胞向多核巨细胞和破骨细胞分化〔4〕。RANKL／RANK相互作用受到OPG的抑制，OPG是可溶性诱饵受体可结合并中和RANKL，事实上在界膜中血管内皮细胞是产生OPG主要细胞，并且远离RANKL／RANK相互作用活跃的组织。由于大量RANK阳性的巨噬细胞聚集，局部RANKL表达为上调的成纤维细胞。在这种OPG减少而RANKL增加的环境下促使多核异物巨细胞和破骨细胞的形成〔5〕。一般认为TNFα和IL1主要通过调节OPG／RANKL/RANK系统来影响假体周围骨溶解。但是Sabokar〔6〕等研究发现，阻断RANKL诱导破骨细胞形成途径时，细胞因子MCSF和TNFα足以诱导破骨细胞的分化，TNFα和IL1之间也可以协同促进骨溶解，提示当假体周围大量磨损颗粒聚集时，炎性细胞因子也可能不通过OPG／RANKL／RANK系统直接诱导骨溶解。

    2  无菌性松动中的基因治疗

    21  基因治疗的动物模型

    基因治疗的先决条件是可以模拟人类疾病的病因和疾病特点的实验动物模型。无菌性松动常用的实验模型有大鼠、兔、犬、绵羊〔7~11〕，然而，对于基因治疗的研究来说这些动物模型确实存在某些缺点，因为一旦人工假体与宿主骨整合达到可靠固定后，出现类似于临床上的无菌性松动需要花费很长时间。Pap G〔7〕等对大鼠实验模型进行改进，增加每周5 d每天2 h的活动量。尽管机械负荷的增加促进了假体周围界膜的形成，但是6个月之后无明显假体松动的迹象。迄今为止，有两种动物实验模型被用于研究磨损颗粒诱导的无菌性松动生物学病因和基因治疗，并且排除了机械力学方面的影响。一种是建立可以定量测定骨吸收程度的小鼠airpouch动物模型，即将磨损颗粒于即将来源于同系基因BALB／c小鼠的股骨或颅盖骨的骨片作为供体植入异体的airpouch中，在小鼠皮下间隙注入磨损颗粒可以诱导炎性反应结果形成类似于假体周围界膜样组织〔12、13〕。另一种动物模型是将磨损颗粒直接植入小鼠颅盖骨。在1周内，磨损颗粒就可以诱导剧烈的炎症反应，观察到明显的破骨细胞形成和骨溶解现象〔14〕。采用TNF和RANK基因缺陷的小鼠也证实了磨损颗粒诱导骨溶解的原因是由于炎性细胞因子有关〔15、16〕。而且类似的研究也表明TNFR：Fc和RANK：Fc融合蛋白注射入野生型小鼠抑制了磨损颗粒诱导的骨溶解，预示着基因治疗在无菌性松动中的前景〔16、17〕。

    22  腺病毒载体在抑制磨损颗粒诱导的骨溶解中的应用

    腺病毒（Adenovims）为DNA病毒，它能感染各时相的细胞，感染滴度高且不与宿主基因发生整和，因而被较广泛地应用于研究。虽然腺病毒是基因治疗的良好载体，但其表达时间短，容量小（45 kb），且免疫原性强，缺乏理想的动物模型来进行临床前毒性研究，这使得腺病毒作为基因治疗的载体具有一定的危险性。Childs 〔18〕等采用小鼠颅盖骨动物模型研究腺病毒载体可溶性肿瘤坏死因子抑制剂（sTNFR：Fc）是否可阻止磨损颗粒诱导的骨溶解。sTNFR：Fc是一种人Ⅰ型TNF受体细胞外区融合鼠类免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，可以和TNFα结合，阻止膜结合TNF的信号途径。编码LacZ的腺病毒载体（AdCMVNlacZ）和编码TNFR：Fc的腺病毒载体（AdCMVTNFR：Fc）转染颅盖骨组织，10 d后ELISA测定血浆中TNFR：Fc浓度，结果发现AdCMVNlacZ转染了骨膜中约10％的细胞。无论是否加入钛颗粒AdCMVNlacZ组都明显诱导了骨重吸收和破骨细胞的生成。与对照组（无病毒转染）相比，AdCMVTNFR：Fc组也没有明显抑制骨重吸收的面积和减少破骨细胞的生成数量。重复转染无胸腺裸鼠的颅盖骨组织，避免了腺病毒引起的免疫反应，结果表明AdCMVTNFR：Fc组可以减轻骨重吸收程度。说明局部的基因治疗不一定比全身系统的基因治疗更有效，其有效性与血浆TNFR：Fc的浓度有关。然而更重要的是腺病毒载体可以诱导明显的炎症反应，诱导野生型小鼠的骨溶解反应超过磨损颗粒。这与以前很多研究结果相符，所以在临床使用时应提高警惕腺病毒的免疫原性。Carmody〔19〕等体外将携带病毒白介素10靶基因的复制缺乏型腺病毒载体（AdvIL10）转染成纤维样滑膜细胞明显抑制了钛颗粒诱导的炎性细胞因子到基础水平，同时也明显抑制破骨细胞的生成，而加入抗IL10的中和抗体后完全阻断了这种效应。腹腔内注入AdvIL10后，血浆可以检测到vIL10，免疫组化表明环氧化酶2（COX2）和TNFα表达下降。说明vlL10基因转染后可以抑制骨溶解的3个过程：（1）磨损颗粒诱导炎性细胞因子；（2）破骨细胞的生成；（3）骨溶解。

    23  腺相关病毒载体在抑制磨损颗粒诱导的骨溶解中的应用

    腺相关病毒（adenoassociated vires，AAV）能感染增殖和非增殖细胞，免疫源性低，对人不致病，在实际应用中,AAV存在着感染滴度低，负载容量小，转基因效率因细胞或组织类型不同而有较大差异等缺点。尽管如此，以AAV为基础的转基因载体仍有其较为广阔的应用前景。UlrichVinther〔20〕等体外实验将表达OPG的重组腺病毒相关病毒载体（rAAVOPGIRESEGFP）转染胚肾细胞293，4 d后培养基中OPG的浓度达到135ng／mL，rAAVOPGIRESEGFP转染的成纤维细胞与RANK和MCSF诱导的脾细胞共培养后，脾细胞的破骨细胞生成下降了17倍。在小鼠颅盖骨动物模型中rAAVOPGIRESEGFP可以转染肌注点的肌细胞，第2 d就可以发现血浆OPG浓度明显升高，最大浓度出现在第6 d，结果还表明其可以明显抑制骨重吸收的面积和减少破骨细胞的生成数量，也就是说rAAVOPGIRESEGFP转染肌细胞后通过OPG抑制钛颗粒诱导的破骨细胞生成和骨溶解。Yang Sy〔21〕等在airpouch动物实验模型中体外构建编码人OPG基因的腺病毒相关病毒载体（rAAVhOPG）转染airpouch，7 d后取出标本可以发现OPG的表达，调控破骨细胞分化、成熟及激活其功能的最关键因子-RANK表达下降，骨钙释放减少39％，避免了骨胶原的丢失，即rAAVhOPG抑制了超高分子聚乙烯颗粒诱导的骨溶解。

    24  逆转录病毒载体在抑制磨损颗粒诱导的骨溶解中的应用

    逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒，即其所携带的遗传物质为RNA而非DNA，因其自身能合成一种逆转录酶，故能将自身的RNA逆转录为cDNA并整和到宿主DNA中去。其免疫源性小，能稳定整和，效率高，在转移过程中不易受到胞内DNA酶的降解，插入基因表达时间长，是转基因技术应用的主要载体之一。这表明了逆转录病毒作为基因治疗的载体能成为具有靶向性的载体。但不利的是逆转录病毒只能转染处于分裂增殖期的细胞，不仅如此，它与受染细胞的整和具有随机性，故具有潜在的危险性，因此若要将其安全应用于人体，还需进一步改造。Sud〔22〕等采用airpouch动物实验模型。首先体外构建重组人白介素受体拮抗剂（rIL1Ra）和人肿瘤坏死因子可溶性受体（sTNFR）逆转录病毒载体，airpouch内注入骨水泥颗粒48 h和72 h后，用PCR和ELISA测定发现DFGIRAPNeo转导BALB／c系小鼠后稳定表达IL1Ra组织学检测也表明rIL1Ra基因转导后明显减轻了水肿期的炎症反应，减少巨噬细胞的聚集。说明IL1Ra基因治疗是治疗炎症反应的一种可行的方法。Yang〔23〕等建立逆转录病毒介导的vlL10和hIL1Ra体外表达体系转染小鼠airpouch动物模型，7 d后明显降低TNFα、IL1β和IL6的mRNA和蛋白表达水平，降钙素受体、组织蛋白酶K、MCSF、RANK的mRNA表达也明显下降。IL6可能在破骨细胞形成时对IL1β／TNFα的合成和分泌有调控作用，从而促进破骨细胞的分化和成熟。其有效阻止超高分子聚乙烯颗粒诱导的骨溶解的原因可能是由于TNFα、IL1β和IL6等炎性细胞因子分泌受抑制后，重要的破骨细胞形成调节因子MCSF的表达也减少，从而抑制破骨细胞的分化、增殖及成熟。Yang〔24〕等实验研究也证实逆转录病毒介导的人白介素（hIL）1受体拮抗剂基因转染后，可明显降低鼠IL1β、MCSF及RANK的水平，可有效预防超高分子聚乙烯颗粒诱导的骨溶解。Goater〔25〕等应用DNA重组技术，将OPG cDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX中，产生的重组逆转录病毒感染成纤维样滑膜细胞。把转染OPG基因的成纤维样滑膜细胞和30 mg的钛颗粒一起植入小鼠颅盖后完全抑制破骨细胞的生成和骨溶解。而且还发现细胞培养72 h后仅仅有03 ng／ml的OPG。也就是说虽然转染后的细胞表达少量的OPG却有效地阻止了磨损颗粒诱导的骨重吸收反应。Yang SY〔26〕等从全髋翻修术中取出界膜组织植入CB17／SCID小鼠（BALB／C17小鼠的突变系，以重度联合免疫缺陷为特点，此特性为常染色体隐性遗传）的股四头肌和椎旁肌。将植入的界膜组织与编码hlL1Ra蛋白逆转录病毒共培养3 h，RTPCR和免疫组化检测表明IL1β和TNFα表达下降。

    25  自杀基因治疗

    在全髋关节翻修术中在植入新的假体之前需要彻底清除骨骨水泥界面的纤维界膜组织，这样就延长了手术时间，发生术后并发症的几率加大，也增加了手术风险。因此有学者寻找一种替代方法——自杀基因治疗来解决这个问题。自杀基因（suicide gene）疗法又称为病毒导向酶解药物前体疗法。其原理是将某些病毒或细菌中特有的前体转化酶基因——自杀基因用基因工程技术构建在一定的表达载体上并导入细胞中，自杀基因编码的特异性酶类能催化无毒或低毒的药物前体在细胞中代谢生成毒性药物，达到选择性杀伤转染了该基因的细胞，而不伤及正常细胞。de Poorter〔27〕等从翻修术中提取分离出界膜细胞后并进行体外培养，利用腺病毒载体构建HAdV5NTR／CB 1954（人腺病毒硝基还原酶基因／硝苯亚胺）系统，将HAdV5NTR转染入界膜细胞中，结果发现与对照组相比体外培养人的界膜细胞（包含成纤维细胞和巨噬细胞）在接受这种自杀基因后，对CB 1954异常敏感升高了约60倍。当CB 1954的浓度是25 μmol／L时，杀死了50％被转染的界膜细胞，也证实了人腺病毒5可以感染大多数分化和未分化的成纤维细胞和巨噬细胞。NTR／CB 1954途径是具有较高临床价值的，因为:（1）其毒性产物可以杀死分化和未分化细胞。（2）诱导细胞死亡不依赖于p53途径。（3）CB 1954在人体内无毒性。（4）界膜细胞位于封闭的关节腔中，因此载体的局部浓度较高，对全身系统影响较小。这些都提示HAdV5NTR／CB 1954系统是用于无菌性松动的治疗理想的模式。所以说自杀基因疗法的出现，为人工假体无菌性松动的治疗提供了一种较为有效和具有临床应用潜力的治疗策略。

    3  展  望

    目前还没有被批准在临床上用于有效预防和治疗关节假体周围骨溶解的药物。但基因治疗是未来可以抑制骨假体界面炎症反应和骨重吸收的活性的一种有效的方法。尽管基因治疗在许多方面取得了一定的进展，甚至有些基因治疗方案显示了临床试验计划，但目前所进行的工作绝大多数尚处于实验阶段，许多关键性的技术和理论仍有待进一步深入研究。比如说如何开发更多的真正确实有效的目的基因，如何构建安全高效转移并高效表达的载体系统，如何实现基因治疗的靶向性调控，如何实现多基因的联合治疗及基因治疗与其它疗法的联合应用等等，而且由于假体周围骨溶解是一个多因子相互作用、相互调节的复杂过程，作用于单一因子或多个因子究竟能否起到防治效果，尚待进一步研究。这些都是基因治疗中面临的问题，也是未来需要重点研究的几个方面。相信不久的将来，人工关节肢体无菌性松动的基因治疗一定会显示出更加诱人的前景。

    参考文献：

    〔1〕  Haynes DR,Crotti TN,Zreiqat H.Regulation of osteoclast activity in periimplant tissues［J］.Biomaterials，2004，25（20）:48774885.

    〔2〕  CIohisy JC,Frazier E,Hirayama T,et al.RANKL is an essential cytoldne mediator of polymethylmethacrylate particle induced osteoclastogenesis［J］.J Orthop Res,2003,21:202212.

    〔3〕  Baumann B,Rader CP,Seufert J,et al,Effects of polyethylene and TiAIV wear particles on expression of RANK,RANKL and OPG mRNA［J］.Acta Orthop Scand,2004,75（3）:295302.

    〔4〕  Mandelin J,Li TF,Hukkanen M,et al.Interface tissue fibroblasts from loose total hip replacement prosthesis produce receptor activator of nuclear factorkappaB ligand,osteoprotegerin,and cathepsin K［J］.J Rheumatol,2005,32（4）:713720.

    〔5〕  Sabokba A,Itonaga I,Sun SG,et al.Arthroplasty membranederived fibroblasts directly induce osteoclast formation and osteolysis in aseptic loosening［J］.J Orthop Res,2005,23（3）:511519.

    〔6〕  A.Sabokar,O.Kudo,N.A.Athanasou.Two distinct cellular mechanisms of osteoclast formation and bone resorption in periprosthetic osteolysis ［J］.J Orthop Res,2003,21（1）:7380.

    〔7〕  Pap G,et al.Development and characteristics of a synoviailike interface membrane around cemented tibial hemi arthroplasties in a novel rat model of aseptic prosthesis loosening［J］.Arthritis Rheum,2001,44:956963.

    〔8〕  De Man FH,Tigchelaar W,Marti RK,et al.Effects of mechanical compression of a fibrous tissue interface on bone with or without highdensity polyethylene particles in a rabbit model of prosthetic loosening［J］.J Bone Joint Surg Am,2005,87（7）:15221533.

    〔9〕  Skurla CP,Pluhar GE,Frankel DJ,et al.Assessing the dog as a model for human total hip replacement.Analysis of 38 canine cemented femoral components retrieved at postmortem［J］.J Bone Joint Surg Br,2005,87（1）:120127.

    〔10〕  EIWarrak AO,Olmstead M,Schneider R,et al.An experimental animal model of aseptic loosening of hip prostheses in sheep to study early biochemical changes at the interface membrane［J］.BMC Musculoskelet Disord,2004,3:5~7.

    〔11〕  EIWarrak AO,Oimstead M,Apeit D,et al.An animal model for interface tissue formation in cemented hip replacements［J］.Vet Surg,2004,33（5）:495504.

    〔12〕  WRen,SY Yang,PH Wooley.A novel murine model of orthopaedic weardebris associated osteolysiso［J］.Scand J Rheumatol,2004,33:349357.

    〔13〕  Sud S,et al.Effects of cytokine gene therapy on particulate induced inflammation in the murine air pooch［J］.Inflammation,2001,25:361372.

    〔14〕  Schwarz EM,et al.Quantitative smallanimal surrogate to evaluate drag efficacy in preventing wear debrisinduced osteolysis［J］.J Orthop Res,2000,18:549555.

    〔15〕  Schwarz EM,et al.Tumor necrosis factoralpha/nuclear transcription factorkappaB signaling in periprosthetic osteolysis［J］.J Orthop Res,2000,18:472480.

    〔16〕  Childs LM,et al.In vivo RANK signaling blockade using the receptor activator of NFkappa B:Fc effectively prevents and ameliorates wear debrisinduced osteolysis via osteoclast depletion without inhibiting osteogenesis［J］.J Bone Miner Res,2002,17:192199.

    〔17〕  Childs LM,Goater J J,OKeefe RJ,et al.Efficacy of etanercept for wear debrisinduced osteolysis［J］.J Bone Miner Res,2001,16:338347.

    〔18〕  Childs LM,Goater JJ,OKeefe RJ,et al.Effect of antitumor necrosis factoralpha gene therapy on wear debris induced osteolysis［J］.J Bone Joint Surg Am,2001,83:17891797.

    〔19〕  Carmody EE,et al.Viral interleukin.10 gene inhibition of inflammation,osteoclastogenesis,and bone resorption in response to titanium particles［J］.Arthritis Rheum,2002,46:12981308.2000,97:15661571.

    〔20〕  UIrichVinther M,et al.Recombinant adenoassociated virus mediated osteoprotegerin gene therapy inhibits wear debris induced osteolysis［J］.J Bone Joint Surg Am,2002,84:14051412.

    〔21〕  Yang SY,et al.Adenoassociated virusmediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethyleneinduced osteolysis in a murine model［J］.Arthritis Rheum,2002,46:25142523.

    〔22〕  Sud S,et al.Effects of cytokine gene therapy on particulate induced inflammation in the murine air pouch［J］.Inflammation,2001,25:361372.

    〔23〕  Yang SY,et al.IL10 and IL1Ra gene transfer using retroviral vectors ameliorates an experimental inflammatory reaction to orthopaedic wear debris［J］.lnflamm Res,2002,51:342350.

    〔24〕  Yang SY,Wu B,Mayton L,et al.Protective effects of IL1Ra or vIL10 gene ransfer on a murine model of wear debrisinduced ostcolysis［J］.Gene Ther,2004,（5）:483491.

    〔25〕  Goater JJ,et al.Efficacy of ex vivo OPG gene therapy in preventing wear debris induced osteolysis［J］.J Orthop Res,2002,20:169173.

    〔26〕  Yang SY,Sam Nasser,Markel DC,et al.Human periprosthetic tissue implanted in severe combined immunodeficient mice respond to gene transfer of a cytokine inhibitor ［J］.J Bone Joint Surg Am,2005,87:10881097.

    〔27〕  de Poorter JJ,Tolboom TC,Rabelink MJ,et al.Towards gene therapy in prosthesis loosening:efficient killing of interface cells by genedirected enzyme prodrag therapy with nitroreduetase and the prodrug CB1954［J］.J Gene Med,2005,7（11）:14211428.

  
    （南昌大学医学院第一附属医院骨二科，江西南昌  330006）