重组人BMP7真核表达质粒的构建及转染软骨细胞后的表达

　　摘  要：［目的］构建重组人骨形成蛋白7（rhBMP7）基因真核表达质粒，转染兔关节软骨细胞，探讨外源性人rhBMP7基因在转染软骨细胞中的表达情况及对细胞生物学性状的影响。［方法］采用PCR技术扩增rhBMP7基因，将其插入真核表达载体pcDNA 31中，体外分离培养兔关节软骨细胞，然后用构建的rhBMP7质粒转染软骨细胞，经G418筛选、免疫组化染色和逆转录PCR检测其表达，同时检测表达产物对维持软骨细胞表型的作用。［结果］经过PCR及酶切鉴定证实获得了BMP7真核表达质粒pcDNA 31rhBMP7，通过免疫组化染色和逆转录PCR鉴定证实rhBMP7在转染后的软骨细胞中得到了表达，其表达产物促进软骨细胞表型的维持。［结论］外源性rhBMP7基因转染软骨细胞可以获得高效表达，并具有一定的维持软骨细胞表型的作用，为软骨组织工程的研究提供了改良的种子细胞。

    关键词：骨形成蛋白7；  基因转染；  软骨细胞

      Construction of eucaryotic expression plasmid carrying the recombined human BMP7 gene and its expression in chondrocytes∥LU Huading,CAI Daozhang,MA Huihui,et alDepartment of Orthopaedics,the 3rd Affiliated Hospital,Sun YatUniversity,Guangzhou 510630

    Abstract：［Objective］To construct an eucaryotic expression plasmid carrying the recombined human BMP7 gene,and transfect into rabbits articular chondrocytes in vitro,then study its expression in chondrocytes,and make further study on the effects of transfection on biolotical characteristics of these cells［Method］The rhBMP7 gene was cloned into the eucaryotic expression vector pcDNA31At the same time,rabbits articular chondrocytes were isolated and cultured in vitroThe plasmid carrying the rhBMP7 gene was transfected into chondrocytesThen the expression of the transgene was detected by using RTPCR assay and immunohistochemical examination after G418 riddling［Result］PCR and digesting demonstrated that the eucaryotic expression plasmid pcDNA31rhBMP7 was obtainedRTPCR and immunohistochemical examination showed that the rhBMP7 gene was expressed in chondrocytes,and the transgene expression products promote proliferation of chondrocytes［Conclusion］The exogenous rhBMP7 gene could be expressed by transfected chondrocytes effectively,and the transgene expression products could promote maintaining the phenotype of chondrocytesIt provides an ideal seeds for cartilage tissue engineering

    Key words：Bone morphogenetic protein 7;  Genes transfection;  Chondrocyte

    研究表明，骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP7）是成人关节软骨表达的一种合成代谢因子，能维持软骨细胞的表型，诱导软骨细胞外基质如蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，并抑制由白介素1（interleukin1，IL1）介导的软骨基质分解代谢，当发生软骨退变时，内源性的活性BMP7表达显著降低〔1~3〕。作为软骨组织工程的种子细胞，软骨细胞在体外培养时易失去表型而分化为成纤维样细胞，限制了其在软骨组织工程中的应用。本研究通过构建重组人BMP7（recombined human BMP7，rhBMP7）真核表达质粒DNA，转染体外培养的兔软骨细胞，以探讨rhBMP7基因转染后软骨细胞获得表达的情况及对细胞生物学性状的影响。

    1  材料与方法

    11  主要试剂

    DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyelone公司），025%（W／V）胰蛋白酶（含02％ EDTA）、02％（W／V）Ⅱ型胶原酶（Sigrna公司），鼠抗兔Ⅱ型胶原抗体（Calbiochem公司），羊抗人BMP7多克隆抗体（Sigma公司），鼠抗兔S100单克隆抗体（Sigma公司），SABC试剂盒（武汉博士德公司），含BMP7全长cDNA的模板购自美国PTGLAB，其载体为pCMVSPORT6（全长1 815bp）；Tag DNA聚合酶，dNTP购自MBI公司：T4DNA连接酶、BamH Ⅰ酶、EcoR Ⅰ酶及两种酶的buffer购自美国Promega公司；pcDNA31（+）载体购自Novagen公司；Ecoli DH5α购自武汉三鹰生物技术有限公司。

    12  引物的设计与合成

    根据对rhBMP7 cDNA序列的分析自行设计引物，上游引物序列为：5'TTTTAAGCTTATGCACGTGCGCTCACTGCGA，带有一个Hind Ⅲ酶切位点；下游引物序列为：5'TTTTGGATCCCTAGTGGCAGCCACAGGCCCG，带有一个BamH Ⅰ酶切位点。引物的合成由北京赛百盛基因生物有限公司完成。

    13  rhBMP7真核表达质粒的构建

    131  PCR

    反应体系为100 μl，10×Tag buffer 10μl，Tag酶1μl，dNTP 10μl,Mg+210μl，上游、下游引物各2μl，cDNA2 μl，dd H2O 65 μl。于94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 min，共进行25个循环，72 ℃反应5 min。取出后 4℃保存。应用PCR产物纯化试剂盒将阳性结果的PCR产物进行纯化。

    132  酶  切

    pcDNA 31（+）载体和PCR产物的酶切，体系包括：PCR产物46 μl，buffer（EDTA，TrisHcl）12 μl，BamH Ⅰ 1 μl，Hind Ⅲ 1 μl，在37 ℃下分别反应4、8 h。取PCR酶切产物60 μl进行10％琼脂糖凝胶电泳检测阳性片断。

    133  目的片断插入表达载体

    pcDNA 31 2 μl，PCR产物105 μl，T4 DNA连接酶1 μl，10×T4 buffer 15 μl，在22 ℃条件下反应，过夜。

    134  转  化

    制备大肠杆菌感受态细胞Ecoli DH 5α，将含有目的片断的载体质粒转化入大肠杆菌中，鉴定转化菌，Amp筛选，对阳性菌克隆提质粒，进行酶切鉴定。将阳性菌液送测序鉴定（由上海博亚生物科技有限公司完成）。

    14  兔关节软骨细胞的体外分离培养

    以酶消化法分离及进行体外培养2周龄新西兰大白兔关节软骨细胞〔4〕并传代。

    15  pcDNA 31rhBMP7转染软骨细胞

    提取纯化上述构建好的rhBMP7真核表达质粒pcDNA 31rhBMP7，按Effectene Transfection Reagent转染试剂盒说明书进行转染软骨细胞，转染后48 h加入G418，终浓度为400 μg／ml，筛选阳性克隆。

    16  逆转录PCR检测BMP7基因转染软骨细胞后的瞬时表达

    rhBMP7 cDNA序列的成熟肽部分约含540个碱基对，根据这段成熟肽序列设计引物。Primer s：5'ACATGAACGCCACCAACC3'，Primer a：5'TTCCTTTCGCACAGACACC3'，引物上游位点1 150，下游位点1 747。于rhBMP7基因转染软骨细胞48 h后开始检测。采用RNeasy Mini Kit RNA提取试剂提取转染细胞的总RNA（以细胞数相同的未转染细胞为对照），按照RT试剂盒的说明反转录合成cDNA的第1链，并以此为模板进行PCR反应，PCR反应体系为50 μl，加入cDNA 5 μl，10×PCR Buffer 5 μl，25 mmol／L dNTP 5 μl，上游、下游引物各05 μl（20 μmol／L），Taq酶25 U。94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃ 10 min。PCR反应产物用电泳回收。

    17  荧光定量PCR检测

    Onestep RTPCR试剂盒、SYBR Green Ⅰ为QIGEN公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行，反应条件为：逆转录50 ℃ 30 min，95 ℃热变性15 min；PCR 94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；在50～99 ℃做溶解曲线，最后降温至37 ℃保存。所用仪器为美国ABI 7 000荧光定量PCR仪。应用ABI Prism 7 000 SDS Version 11软件对实验结果进行分析，采用对数平均值计算拷贝数。利用已知起始拷贝数的质粒标准品作标准曲线，标准曲线在106～102 copies／reaction这一很大的范围内有很好的线性关系，最小可以检测到102个DNA拷贝。在确定了标准检测曲线之后，采用同样条件对所采取的样品利用实时定量PCR技术测定样品中的DNA拷贝数。样品为细胞数相同的rhBMP7基因转染的软骨细胞和未转染细胞抽提的总RNA。

    18  rhBMP7基因转染软骨细胞后的稳定表达检测

    采用G418筛选和免疫组织化学染色。细胞转染48 h后，待细胞生长接近融合时按1∶4传代，继续培养至50％～70％融合时，弃去培养基，换含终浓度为400 μg／ml G418的培养基开始筛选。6 d后换含终浓度为150 μg／ml G418的培养基维持筛选，将筛选后形成的细胞克隆消化下来进行细胞爬片，冷丙酮固定，进行BMP7免疫组织化学染色（SABC法）。

    19  免疫组织化学检测pcDNA3，1rhBMP7基因转染对软骨细胞S100表达的影响

    将经过G418筛选3周后形成的阳性细胞克隆消化下作细胞爬片，冷丙酮固定30 min，以同样培养时间的未转染软骨细胞为对照，进行S100免疫组织化学染色。

    2  结  果

    21  rhBMP7的PCR扩增

    以原始cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，得到大小约1 300 bp左右DNA片段，经10％琼脂糖电泳，扩增带清晰，大小与预期相符合。

    22  rhBMP7真核表达质粒的构建及酶切鉴定

    rhBMP7的PCR扩增产物经酶切后，插入真核载体pcDNA 31，经转化Ecoli DH 5α，挑选阳性克隆，抽提质粒，用Hind Ⅲ和Bam H Ⅰ进行酶切，得到两条带：5 400 bp（载体）；1 300 bp（目的片断），与预期大小一致。

    23  体外培养软骨细胞特点

    刚分离的软骨细胞为球形，具折光，台盼蓝拒染，活细胞率达95％。24 h后细胞开始贴壁，逐渐伸展为三角或多角形，胞核大而圆，胞浆丰富，内含分泌颗粒（图1）。细胞保持单层生长，约10 d铺满培养瓶，传代后增殖速度加快，4 d铺满培养瓶。随着传代次数的增加，增殖速度开始减慢，当传到第6代时，细胞分裂能力明显下降，细胞变形明显，体积变大，梭形为主，边缘模糊，折光性弱，表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势（图2）。     图1元代软骨细胞  （×100）图2第6代软骨细胞  （×200）24  rhBMP7转染软骨细胞后的瞬时表达

    逆转录PCR检测，扩增得到了相应的DNA片段，而未经转染的细胞则明显表达较弱。实时荧光定量RTPCR测定：进行实时定量PCR分析需要作出标准曲线。以10倍梯度稀释已知浓度的质粒DNA做出标准曲线（图3），采用不同浓度的标准样品（质粒DNA）进行实时定量PCR后得到数据与预计数值间经t检验，P＞005，两者无显著差异，反应中加入105~101的标准样品，可以得到（图4）的反应曲线，随着浓度的降低，两个10倍浓度之间的DNA扩增差异比较明显，Ct（threshold cycle，Ct）值有明显差别。由于非特异引物产物（如引物二聚体）的解链温度相对于特异性产物低，利用解链曲线可将特异和非特异产物区分开，如（图5）所示，特异性产物在85℃处形成单一的荧光峰。峰值之前曲线比较平滑，没有明显的峰值，可以反应扩增产物的特异性强。对样品分析后得到结果（图6），将同一样品重复做5次，得到BMP7基因拷贝数在转染后软骨细胞和未转染的软骨细胞分别为（4 750±790）及（264±137）（均数±标准差），两者有显著差异（P＜005）。证明rhBMP7基因转染软骨细胞后其BMP7表达水平有明显变化。

    25  BMP7基因转染软骨细胞后的稳定表达 pcDNA 31BMP7转染软骨细胞经G418筛选后，未得到转染的细胞逐渐凋亡，转染细胞长成阳性细胞克隆（图7）。羊抗人BMP7多克隆抗体免疫组织化学检测，镜下见转染的细胞浆有棕黄色颗粒，说明有转染的BMP7的表达，对照组则为阴性。

    26  pcDNA 31rhBMP7基因转染对软骨细胞S100表达的影响鼠抗兔S100单克隆抗体免疫组织化学检测，镜下见转染的细胞浆有棕黄色颗粒，呈阳性反应，对照组呈阴性。

    3  讨  论

    由骨关节炎、创伤和其他各种疾病引起的关节软骨缺损在临床上十分常见，直接影响关节功能，近年来随着组织工程学的发展，软骨缺损的修复取得了一定的进展，但目前在临床上仍不能高质量地修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效。研究表明，软骨细胞在体外培养时易失去表型而分化为成纤维样细胞，而BMP7能维持软骨细胞的表型，促进细胞外基质如蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，抑制软骨基质降解而在软骨组织工程中起重要作用〔2〕。但外源性BMP7来源有限、价格昂贵；半衰期短，易被创伤局部的蛋白酶所水解；在应用于深部组织时，由于需要反复加入而难以为人所接受；且治疗剂量相对较大，有可能导致毒性作用的产生限制了其应用。采用缓释技术将生长因子用微球囊包裹后与支架材料复合虽然可能因生长因子缓控释放而产生生物学效应，但由于采用微球囊技术后不同程度影响材料的力学性能；材料本身的分子量大小、PH值和制作时的溶液浓度等也影响微球囊的控缓释性能;以及在材料的制备过程中生长因子会暴露于有机溶剂、高温及高浓度的表面活性物质中，这样不但影响生长因子的生物活性，同时会促使其降解和增加免疫毒性〔5〕。通过将含生长因子的cDNA转染软骨细胞，使之在体内一定时间内持续表达内源性生长因子，维持软骨细胞的生物学性状，可能成为解决该问题的一个途径。

    本实验在Effectene介导下将rhBMP7基因转染兔关节软骨细胞，通过免疫组化和RTPCR证实转染后的软骨细胞可以表达rhBMP7基因，且细胞转染经G418筛选至4周仍有表达，表明转染细胞存在稳定表达。S100免疫组化检测结果表明转染细胞的表达产物可以促进维持软骨细胞的表型。尽管rhBMP7基因转染软骨细胞可获得高效的表达，在局部持续合成生长因子，但目前这种采用非病毒载体的转染效率相对较低，要获得足够数量的基因转染细胞，需要较长时间的培养和筛选，随着培养时间的延长基因表达产物产生的效应也逐渐减弱，说明目的基因随着细胞的分裂、传代而逐渐丢失并不能长期表达。Hidaka C等〔6〕将BMP7基因转染软骨细胞移植修复关节软骨缺损，发现在早期能加快形成透明软骨，但在远期则与对照组没有明显差别，可能与无法在局部长期维持有效的生长因子水平有关。而采用病毒性载体虽然转染效率较高，但由于人体自身具有抗病毒的免疫系统，因而病毒极易引起人的免疫反应；另外病毒具有自我复制的功能，故对使用病毒的安全性存有顾虑。目前如何调控转入基因在需要的时间内有效表达仍需进一步的深入研究。采用高分子载体的缓控基因释放以实现基因治疗和组织工程支架材料的相结合，促使种子细胞、生长因子和支架三者形成合理的相互作用是进一步研究的方向。     图3根据质粒DNA所作的标准曲线（实时荧光定量PCR）图4标准品反应曲线（实时荧光定量PCR）图5标准品溶解曲线（实时荧光定量PCR）图6样品反应曲线（Ct值22为实验组，Ct值28为对照组）图7pcDNA 31rhBMP7转染软骨细胞后，G418筛选，阳性细胞长成克隆，未转染的细胞逐渐死亡（×100）

　　参考文献：

    〔1〕  Merrihew C,Kumar B,Heretis K,et al.Alterations in endogenous osteogenic protein1 with degeneration of human articular cartilage［J］.J Orthop Res,2003,21（5）:899907.

    〔2〕  Vinall RL,Lo SH,Reddi AH.Regulation of articular chondrocyte phenotype by bone morphogenetic protein 7,interleukin 1,and cellular context is dependent on the cytoskeleton［J］.Exp Cell Res,2002,272（1）:3244.

    〔3〕  杨物鹏，许建中.BMP2对培养兔关节软骨细胞代谢的影响［J］.中国矫形外科杂志,2001，8（1）：5658.

    〔4〕  翟喜成，王英振.Pluronic F127负载同种异体软骨细胞修复兔全厚关节软骨缺损的实验研究［J］.中国矫形外科杂志,2003，11（15）：10531055.

    〔5〕  Bonadio J.Tissue engineering via local gene delivery:update and future prospects for enhancing the technology［J］.Adv Drug Deliv Rev,2000,44（2~3）：185194.

    〔6〕  Hidaka C,Goodrich LR,Chen CT,et al.Acceleration of cartilage repair by genetically modified chondrocytes over expressing bone morphogenetic protein7［J］.J Orthop Res,2003，21（4）：573583.

    （中山大学附属第三医院，1a骨科；1b传染科；1c中心实验室；广州  510630）