聚蛋白多糖酶与骨关节炎研究进展

【关键词】  聚蛋白 骨关节炎

     软骨细胞合成和降解软骨细胞外基质（ECM）大分子，而基质又可维持细胞内环境的稳定和软骨结构。骨关节炎（OA）疾病的主要病理特点是ECM的降解超过其合成，引起软骨基质净含量的减少，覆盖关节骨表面的软骨甚至可完全耗损。其中ECM的重要成分聚蛋白多糖的丢失被认为是关节炎的主要早期表现，最初发生于关节表面，以后进展至深区，随后出现胶原纤维降解和组织力学障碍。引起软骨降解的原因有很多，但该过程最主要的原因是蛋白水解酶活性增高。基质金属蛋白酶（MMPs）曾被认为是降解软骨聚蛋白多糖和胶原的主要酶类〔1〕。而最近发现的一组被称作“聚蛋白多糖酶（Aggrecanase）”的带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS）家族成员被认为在OA的发病过程中有更重要的作用。本文对聚蛋白多糖酶在OA发病过程中的作用研究综述如下。

    1  聚蛋白多糖酶的发现

    已有研究证实，MMPs是在聚蛋白多糖核心蛋白的球间区（IGD）Asn341Phe342位点裂解聚蛋白多糖〔2〕（图1），产生的聚蛋白多糖片段分别为G1DIPEN和FFG。然而，1991年Sandy等〔3〕报道，用炎性细胞因子IL1处理牛关节软骨可诱发软骨降解，聚蛋白多糖的裂解发生于IGD的Glu373Ala374位点，产生的聚蛋白多糖片段是G1NITEGE和APG。这种新的具有蛋白水解活性的酶被称作“聚蛋白多糖酶”。在Glu373Ala374位点切割产生的聚蛋白多糖片断积聚在OA及炎性关节炎患者的滑液中〔4〕，表明聚蛋白多糖酶在体内的潜在重要性。

    图1聚蛋白多糖的结构和酶切位点    尽管自1991年以来人们便考虑有“聚蛋白多糖酶”的存在，但是直到1999年《科学》杂志才报道了第1个克隆纯化的聚蛋白多糖酶，即Aggrecanase1〔5〕，随后同一研究小组又报道了第2个聚蛋白多糖酶——ADAMTS11（Aggrecanase2）〔6〕。聚蛋白多糖酶1和2，现在分别被命名为ADAMTS4和ADAMTS5。它们为含有锌的金属蛋白酶，其结构和序列的排列与ADAMTS具有同源性。在对ADAMTS家族的其他成员进行研究后发现，ADAMTS1和ADAMTS8也具有聚蛋白多糖酶活性，在软骨中也可见到它们的表达〔7、8〕。但是由于ADAMTS1和ADAMTS8的作用比较弱，因此被公认的聚蛋白多糖酶只有2个：ADAMTS4和ADAMTS5（也被称为ADAMTS11）。

    2  聚蛋白多糖酶在骨关节炎中的作用

    在OA软骨中ADAMTS4和ADAMTS5均明显增多〔9〕。OA关节中也有ADAMTS4和ADAMTS5的基因表达，而且ADAMTS4 mRNA在OA软骨中的表达明显上调〔10〕。OA软骨及滑液中有较多的聚蛋白多糖酶产生的聚蛋白多糖裂解片断〔4〕。但是由于OA软骨〔11〕和滑液〔4〕中同时也存在MMPs产生的聚蛋白多糖片断，所以在生理和病理情况下究竟哪一组酶对聚蛋白多糖的降解起主要作用一直是近年来人们讨论的热点。

    G1VDIPEN和G1NITEGE片断均可保持与透明质酸的连接存留在软骨中，用识别各自片段羧基端新抗原表位的抗体可对这2种片断进行检测。应用该方法研究发现，在正常人软骨，2种新的抗原表位均可见，并随着年龄的增长而增加〔11〕。在大多OA软骨中，2种新抗原表位的分布类似，说明MMPs和聚蛋白多糖酶在软骨破坏的病理过程中同样起作用，而在某些OA病例中，在无G1VDIPEN的部位仍可检测到G1NITEGE新抗原表位〔12〕，这虽然不能说明聚蛋白多糖酶的作用更强，但表明2种酶可在软骨的不同部位发挥作用，而且聚蛋白多糖酶的作用部位可能更多。

    有研究发现，正常成人软骨至少包括7种含有G1区的聚蛋白多糖类型〔13〕，分别为：全长聚蛋白多糖、G1NITEGE373、G1VDIPEN341片断，以及其他4种去糖基化后分别为89.289、109.131、158.736 ku和248.025 ku的片段。后4种片段在体内很可能由MMPs生成。然而，核心蛋白的构成在OA软骨中并未改变，相反，滑液中则含有较多的由聚蛋白多糖酶产生的片断，在急性损伤关节的软骨和滑液中，聚蛋白多糖酶产生的G1NITEGE与MMPs产生的G1VDIPEN的比值明显增高。在这些观察发现的基础上，研究者提出聚蛋白多糖酶活性过高对软骨基质具有破坏作用，而MMP活性无破坏性，因为MMP主要修剪聚蛋白多糖分子的C末端区域，且其产生的含有GAG的片断大多存留于组织中，在维持软骨内环境稳定起一定作用。由于被MMP裂解的IGD不再对聚蛋白多糖酶敏感〔14〕，因此这些片断能抵抗聚蛋白多糖酶进一步破坏。

    在短期体外软骨培养模型中，受IL1、TNFα或维甲酸刺激后，至少在最初几周，聚蛋白多糖酶表现为降解聚蛋白多糖的主要酶，虽然MMP3和MMP13 mRNA表达增高，但MMPs几乎不起作用，大约培养3周后，可检测到MMP依赖的聚蛋白多糖核心蛋白的降解，此时胶原的降解也开始发生〔15〕。尽管有报道用IL1或维甲酸处理猪软骨，5 d后软骨中MMP产生的聚蛋白多糖片断增多，但在随后便被指出这只是一个实验假象〔16〕。这样，在体外软骨培养体系中，最初降解聚蛋白多糖的酶是聚蛋白多糖酶，而在后期阶段MMPs才发挥作用〔15〕。

    用关节炎模型实验发现，聚蛋白多糖和MMP都参与了软骨降解。在抗原诱导型关节炎鼠模型中聚蛋白多糖缺失的早期阶段，仅存在NITEGE新抗原表位（聚蛋白多糖产生），不存在VDIPEN抗原表位（MMP产生），当聚蛋白多糖降解进一步发展时，可检测到VDIPEN抗原表位，与此同时，胶原酶开始裂解Ⅱ型胶原〔17〕，也说明MMP仅在OA的后期才起作用。

    应用基因敲除技术发现，在MMP3基因敲除小鼠的抗原诱导型关节炎软骨中，既不出现VDIPEN抗原表位，也没有胶原酶裂解的新抗原出现，而MMP3（-／-）和野生型小鼠其蛋白多糖缺失的程度相同，故聚蛋白多糖降解的媒介可能是聚蛋白多糖酶；在更严重的胶原诱导型关节炎模型中，MMP3（-／-）小鼠关节炎发展的程度与野生型的类似〔18〕。也就是说，尽管在MMP家族中MMP3分解ECM能力最强，但是其基因敲除后并不能阻止OA的发生。而Glasson等〔19〕发现，小鼠ADAMTS5（聚蛋白多糖酶2）基因敲除后，OA的发生程度明显减轻，可以抑制OA的发生和发展。Stanton等〔20〕也发现ADAMTS5是小鼠体内和体外实验中软骨降解的主要酶，但是还不知道这种结果在人软骨中是否一样。

    3  聚蛋白多糖酶表达的调节

    在蛋白质水平上，ADAMTSs是以前蛋白前体的形式合成，并通过分泌途径排出。它们可能是在细胞内被前蛋白转化酶活化，而以活性酶的形式分泌。成熟的全长ADAMTS4（74.407 ku）还要经过进一步的细胞外加工，被裂解为59.526 ku和49.605 ku 2种形式。这些附加的加工过程明显增加了聚蛋白多糖酶的活性，表明翻译后加工是该酶在体内重要的调节机理〔21〕。

    ADAMTSs的蛋白水解活性具有高度选择性。这些酶的高度选择的特异性取决于它们的非催化序列，多糖链与酶的相互作用对聚蛋白多糖酶的活性至关重要。C末端有13个残基（P残基）对聚蛋白多糖酶在Glu373Ala374位点裂解聚蛋白多糖是必不可少的〔22〕。被MMP降解的IGD不再对聚蛋白多糖酶敏感，而聚蛋白多糖酶裂解的IGD仍可被MMPs在Asn341Phe342位点水解〔14〕。不仅是IGD的初级结构，其次级结构对聚蛋白多糖酶识别底物也是必需的。

    在基因水平上，有关诱导性刺激物对聚蛋白多糖酶mRNA表达的影响的报道差别很大。例如：用IL1、TNTa或维甲酸处理培养的正常人软骨，可增加聚蛋白多糖酶活性，但不影响ADAMTS1、ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA的表达〔23〕，提示聚蛋白多糖酶活性的增加可能是经过翻译后调节或由尚未确认的聚蛋白多糖酶所致。另有报道，人软骨细胞经IL1刺激后，可增加ADAMTS4 mRNA的表达〔24〕。还有报道在永生化人软骨细胞中，IL1和制瘤素M共同作用可增加ADAMTS4 mRNA的表达，而其中任一种细胞因子单独作用则无此影响〔25〕。

    牛软骨细胞和牛关节软骨经IL1刺激后，均可增加ADAMTS4 mRNA的表达〔26〕，聚蛋白多糖酶的活性也明显增强〔3〕。

    有几项研究发现，IL1对ADAMTS5 mRNA的表达没有或仅有轻微影响〔24、26〕。另有研究报道，IL1可增加猪关节软骨〔27〕和永生化人软骨细胞中ADAMTS5 mRNA的表达〔25〕。还有研究显示IL18可以上调人软骨的ADAMTS5 mRNA的表达，但对ADAMTS4 mRNA的表达则没有明显影响〔28〕。

    这些报道的差异和矛盾表明，ADAMTS4和ADAMTS5转录和翻译的调节机理依赖于所研究的物种、组织年龄和分离细胞的培养状况。mRNA的稳定性和半衰期也会影响结果。

    聚蛋白多糖酶mRNA表达调节还与细胞类型有关。尽管牛软骨细胞和牛关节软骨经IL1刺激后，均可增加ADAMTS4 mRNA的表达〔26〕，但用IL1或维甲酸处理牛滑膜，并不改变ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA的表达〔29〕。用IL1或TNFα处理人滑膜细胞也不改变ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA的表达〔10〕。

    可以下调聚蛋白多糖酶mRNA的有环孢菌素A和n3脂肪酸。用环孢菌素A处理猪关节软骨，可去除IL1诱导的ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA表达的增加〔27〕。给牛软骨细胞补充n3脂肪酸，可降低IL1诱导的ADAMTS4的mRNA表达，但不影响ADAMTS5的表达〔30〕。用n3脂肪酸处理人OA软骨，也具有类似的对ADAMTS4 mRNA表达的抑制作用，同时伴有软骨聚蛋白多糖酶活性的降低〔31〕。迄今为止n3脂肪酸和环孢菌素A对这些基因的调节机理还不清楚。

    4  聚蛋白多糖酶抑制剂

    TIMP3是聚蛋白多糖酶的内源性抑制剂。TIMPs通常被认为是MMPs的特异性抑制剂，但TIMP3较特殊，人TIMP3的重组N末端抑制序列可抑制ADAMTS4和ADAMTS5，其抑制常数（Ki值）低于纳摩尔，明显小于对MMPs抑制所需浓度，表明TIMP3是聚蛋白多糖酶1和2的强大内源性抑制剂〔32〕。

    因聚蛋白多糖酶的克隆纯化时间不长，因此其合成抑制剂的研究也较少。除了n3脂肪酸和环孢菌素A可以下调聚蛋白多糖酶mRNA以外，一种琥珀酸氧肟酸化合物含有3羟苯基和cis（1S）（2R）氨基2茚醇，对聚蛋白多糖酶有较好的选择性，并且口服有效〔33〕。另几种在P1部位有二苯基苯酚的化合物，对聚蛋白多糖酶的抑制能力则更强，其IC50在很低的纳摩尔范围〔34〕，而且这几种化合物对MMP1和MMP9也有很好的抑制能力。

    综上所述，在OA软骨和滑液中均可见聚蛋白多糖酶产生的聚蛋白多糖产物，表明它们参与了软骨聚蛋白多糖的分解代谢，因为它们是最近才被发现的一组酶，有关其生理及病理意义的认识还很有限，其在体内软骨降解中发挥的作用及其作用的程度尚待研究。可以确定的是：在体外培养的软骨降解初期，聚蛋白多糖酶起了主要作用。ADAMTS5基因敲除后小鼠的OA受到抑制，而敲除MMP3却不能达到同样效果，提示在OA的发病过程中聚蛋白多糖酶可能比MMPs的作用更大。是否如部分作者所言MMPs主要参与聚蛋白多糖的正常更新，聚蛋白多糖酶主要参与软骨降解的病理过程尚待进一步证实。为了明确这些蛋白水解酶在OA中的精确作用，选择特异性的抑制剂，或去除特异性基因的研究是有必要的。这些实验结果将有助于研制新的药物，以预防或治疗骨关节炎。

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作者单位：1.山东大学山东省千佛山医院骨关节中心，济南 250014；2.山东大学齐鲁医院骨科，济南 250012