hIGF1基因在退变椎间盘中的表达△

【摘要】  探讨hIGF1基因在退变椎间盘中的表达。［方法］参考文献〔1~3〕制备出椎间盘退变（intervertebral disk degeneration，IVDD）动物模型24只，随机分为Ad／CMVhIGF1、hIGF1生长因子及PBS组，每组有新西兰大白兔8只。L4、5、L5、6椎间盘中分别注射第2代Ad／CMVhIGF1（8×108 PFU）、hIGF1生长因子（100 μg/L）、PBS 25 μL。注射后1、2、4、8周，Western blot检测椎间盘中hIGF1蛋白表达。［结果］hIGF1蛋白带出现在7 539.96 μ。Ad／CMVhIGF1、hIGF1蛋白表达持续达4周以上，hIGF1组表达持续约2周；PBS注射组无hIGF1蛋白表达。［结论］hIGF1基因能够在退变椎间盘中表达；hIGF1基因转染表达的持续时间长于单纯hIGF1生长因子直接注射。

【关键词】  椎间盘 退变 hIGF1

    Human insulinlike growth factor1 gene expression on intervertebral disk degeneration∥HUANG Zongqiang,LIU Shangli,ZHENG Zhaomin.Department of Orthopaedics,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

    Abstract：［Objective］To study hIGF1 gene expression on intervertebral disk degeneration.［Method］Twentyfour male NewZealand rabbits IVDD models were made according to reference and randomly divided into Ad／CMVhIGF1,hIGF1 growth factor and PBS group.Twenty five microlitre the second generation Ad／CMVhIGF1（T=80×109 PFU/L）,hIGF1 growth factor（100 μg/L）and PBS were respectively injected into L4、5,L5、6 intervertebral disk under fluoroscopic guidance.One,two,four and eight weeks postoperation,rabbits were sacrificed,intervertebral disk samples were harvested.Total proteins of equal mass intervertebral disks were extracted,isolated in SDSpolyacrylamide gel electrophoresis（SDSPAGE）and transferred to polyvinylidene difluoride（PVDF）Millipore.The hIGF1 growth factor expression were indentified with Western blot.［Result］The hIGF1 interest protein existed at 7.6 kiloDalton.At one week after injection,its expression quantities were almost equal between Ad／CMVhIGF1 and hIGF1 growth factor group.At two week after injection,it obviously declined in hIGF1 growth factor group.At four week after injection,it still expressed in Ad／CMVhIGF1 group.At eight week after injection,it did not express in three groups.［Conclusion］Ad／CMVhIGF1 successfully infects degenerative intervertebral disk.In Ad／CMVhIGF1 group,the hIGF1 gene expression lasts longer than that in hIGF1 growth factor group.

    Key words:intervertebral disk;  degeneration;  insulinlike growth factor1

    椎间盘退变（intervertebral disk degenergion，IVDD）的确切分子生物学机制尚不明确，多数学者认为IVDD为多因素协同作用的结果，与椎间盘中细胞营养下降、力学及遗传等因素有关。但细胞因子减少及致炎因子增多等分子生物学改变在发病中起主要作用〔4〕。1991年，Thompson等〔5〕检测了多种细胞因子能够促进犬椎间盘细胞分泌细胞外基质，开始了生长因子应用于椎间盘的体外实验研究，而后相继出现了多篇文献报道〔6〕。但椎间盘细胞的体外培养条件与体内椎间盘细胞所处的内环境有明显差异；生长因子维持作用短暂；发挥作用需要多次或者连续给药，造成给药途径引发感染等；另外生长因子的费用亦不菲。转基因技术的发展为解决生长因子持续作用于椎间盘带来便捷之道。Nishida等〔7、8〕以腺病毒为载体，将LacZ基因、TGFβ1基因转染到正常成年兔椎间盘获得成功。但与正常椎间盘有明显区别的是，椎间盘发生退变后，其细胞数量减少，功能不活跃，在生物学特性方面与正常细胞存在明显差异。退变的椎间盘细胞在椎间盘退变的生物学环境中能否被转染仍是未知。即便能够转染，转染后基因表达水平如何，能否起到修复IVDD的作用，均需进一步研究。本研究将自行构建的Ad／CMVhIGF1载体〔9〕直接注入新西兰大白兔IVDD模型〔1~3〕，观察hIGF1表达水平情况。

    1  材料与方法

    1.1  主要实验材料、仪器及设备

    蛋白质检测试剂盒（BioRad公司，美国）；鼠抗人IGF1单克隆抗体（R&D Systems Inc，美国）；辣根过氧化物酶结合的抗鼠IgG（Santacruz Biotechnology,英国）；预染蛋白质分子量Marker（New England BioLabs Inc，英国）；PVDF膜（Millipore，美国）；丙烯酰胺，抑蛋白酶肽，苯甲基磺酰氟及N，N亚甲双丙烯酰胺（Amresco，美国）；N，N，N，N四甲基乙二胺（Sigma，美国）；恒压恒流水平电泳仪及垂直电泳电转移槽（BioRad，美国）；XW80漩涡振荡器及振动摇床（上海跃进医疗器械厂，中国）。

    1.2  hIGF1生长因子、第2代Ad／CMVhIGF1载体溶液的配制

    将hIGF1生长因子用PBS溶液稀释，分装入EP管中，每管2.5×10-3μg，-70 ℃保持。使用前加PBS至25 μL，每个椎间盘注入的剂量为2.5×10-3μg。参考文献〔10〕合成的第2代Ad／CMVhIGF1载体稀释到每25 μL含有2×106 PFU。每个椎间盘注入的腺病毒总量为2×106 PFU。

    1.3  腰IVDD动物模型制备、给药及标本制备

    参考文献〔1~3〕制备出腰IVDD动物模型24只，随机分为Ad／CMVhIGF1、hIGF1生长因子及PBS组，每组有新西兰大白兔8只。实验动物用氯氨酮针35~50 mg／kg、氯丙嗪针10~25 mg／kg联合肌肉注射，动物麻醉成功后，右侧卧位于手术台（本研究组设计定做）。在X线透视下，用硬脊膜穿刺针穿刺L4、5、L5、6椎间盘，穿刺成功后，拔出硬脊膜穿刺针内塞，放入腰麻针。用100 μL微量移液器依动物分组各注射携带hIGF1基因的腺病毒载体（滴度为80×109 PFU／L）、hIGF1生长因子（100 μg／L）、PBS，注入容量均为25 μL。分别于注射后1、2、4、8周，各组实验动物均取2只，动物麻醉后，穿刺耳缘静脉注入10 ml空气致死。迅速切取腰椎全段，切除椎板及附着肌肉，分别切取L4、5、L5、6椎间盘，去除上下软骨终板；仅保留完整的纤维环、髓核组织。

    1.4  Western blot检测hIGF1蛋白表达

    1.4.1  组织总蛋白质提取及浓度测定

    （1）组织剪碎：于0 ℃以PBS充分洗涤组织碎片，4 ℃ 3 000 r/min离心5 min，估算离心管底部沉淀物体积；吸出上清液；（2）以5倍体积预冷的悬浮缓冲液分散组织碎片，尽快加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液；（3）将样品置于沸水浴中加热10 min，采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切；（4）于室温以10 000 r/min将样品离心10 min，将上清液移于另一管中，弃去沉淀物；（5）按BioRad蛋白质检测试剂盒说明检测样品蛋白浓度。

    1.4.2  Westernblot检测hIGF1蛋白表达

    （1）制备SDS聚丙烯酰胺分离胶（8 ml）、12％的SDS聚丙烯酰胺浓缩胶（3 ml）；（2）加样：每样本各取总蛋白50 μg，加等体积2×SDS上样缓冲液（约10 μL）混匀，另一管加预染蛋白Marker（用于考马斯亮蓝染色）或辣根过氧化物酶结合的生物素化蛋白Marker（用于Westernblot）20 μL，瞬时离心使溶液沉于管底，标本和蛋白Marker均于沸水中煮沸3~5 min，按顺序用微量加样器将每管样本中的全部溶液或蛋白Marker加入样品孔中；（3）电泳：于120V恒压条件下电泳，当溴芬蓝染料进入分离胶后，电泳条件改为恒压220 V，继续电泳直至染料达到胶底；（4）考马斯亮蓝染色：取出电泳玻板，小心取出凝胶，将疑胶放入一培养皿中，倒入0.25％考马斯亮蓝染色液，放在摇动的脱色摇床上于室温染色40 min。然后倒出并回收染色液，加入脱色液，平缓摇动，直到出现明显的蓝色的蛋白条带；（5）半干式电印迹转膜，Western Blot检测hIGF1生长因子表达：用封闭液封闭PVDF膜；用0.1 mol／L PBST洗涤PVDF膜5 min×1次；用一抗孵育PVDF膜，4 ℃过夜；用0.1 mol／L PBST振荡洗涤PVDF膜5 min×2次；37 ℃用1∶200的二抗孵育PVDF膜1 h；用0.1 mol／L PBST振荡洗涤PVDF膜5 min×4次；DAB显色。

    2  结  果

    注射后1、2、4及8周，SDSPAGE显示3组实验动物的椎间盘组织均有不同分子量的蛋白条带，肉眼观察在蛋白表达量上无明显差异。Westernblot显示hIGF1目的蛋白带出现在7 539.96 μ，与理论值相符（图1）。注射后1周，Ad／CMVhIGF1注射组、hIGF1注射组均出现hIGF1蛋白带，其表达量大致相同，PBS注射组无目的蛋白带出现（图2）；注射后2周，Ad／CMVhIGF1注射组、hIGF1注射组仍出现hIGF1蛋白带，但hIGF1注射组表达量明显下降；注射后4周，Ad／CMVhIGF1注射组出现hIGF1蛋白带，但表达量已经开始下降，hIGF1注射组未出现hIGF1蛋白带（图3）；注射后8周，3组实验动物的椎间盘组织均未出现hIGF1蛋白带。

    3  讨  论

    Westernblot是检测目的基因在组织中表达的较常用且最灵敏的方法。本研究采用Westernblot手段检测注射到兔椎间盘中的hIGF1目的基因、生长因子等的表达，发现术后1周，2组中均有hIGF1目的蛋白的表达，且表达量基本相同；术后2周，在2组中仍能检测到hIGF1的表达，但生长因子组表达量明显下降，术后4周，仅能在hIGF1目的基因组检测到hIGF1的表达。PBS组无hIGF1的表达。实验结果说明：hIGF1目的基因在兔椎间盘中的表达至少持续4周以上，而hIGF1生长因子在兔椎间盘中存在仅2周左右。hIGF1生长因子持续时间较短可能与生长因子的半衰期有关。

    图1注射后不同时期，Ad／CMVhIGF1组hIGF表达的Western blot鉴定  M:蛋白marker;Lane 1:注射后1周；Lane 2：注射后2周；Lane 3：注射后4周；Lane 4：注射后8周  图2注射后1周，3组hIGF1表达的Western blot鉴定  M：蛋白marker;Lane 1:Ad／CMVhIGF1组；Lane 2:hIGF1生长因子组；Lane 3:PBS组  图3注射后4周，3组hIGF1表达的Western blot鉴定  M：蛋白marker;Lane 1:Ad／CMVhIGF1组；Lane 2:hIGF1生长因子组；Lane 3：PBS组    Nishida等〔7、8〕将Lac Z标志基因直接注射兔椎间盘，结果显示标志基因的表达至少持续12周左右。Paul等〔11〕将SOX9基因用腺病毒携带直接注射兔椎间盘，发现其表达持续5周以上。季爱玉等〔12〕研究发现hTGFβ1基因表达对椎间盘蛋白多糖的影响持续达12周左右。本研究目的基因的表达与文献报道存在差异，原因可能如下：（1）实验动物不同：本实验采用兔椎间盘退变模型，而文献中采用正常的新西兰大白兔。正常和退变的新西兰大白兔椎间盘内环境可能存在极大的差异。（2）腺病毒的纯度存在差异：本研究由于实验室无低温超速离心机，故对实验所用的腺病毒未进行纯化处理。文献中可能采用的腺病毒纯度较高。（3）实验检测手段差异。（4）腺病毒滴度差异。Paul等采用的病毒滴度为1×109 PFU。季爱玉等采用的为6×106 PFU。本研究采用的病毒滴度为2×106 PFU。另外，本研究只是椎间盘退变hIGF1基因治疗的课题的一部分，hIGF1基因表达对椎间盘退变的影响将另文发表。

【参考文献】
  〔1〕 黄宗强，刘尚礼，郑召民，等.双侧关节突关节切除致椎间盘退变的影像学观察［J］.中国矫形外科杂志，2006，14（23）：18101812.

〔2〕 黄宗强，刘尚礼，郑召民.椎间失稳诱发椎间盘退变的病理学观察［J］.中国矫形外科杂志，2007，15（5）：376379.

〔3〕 黄宗强，刘尚礼，郑召民.双侧关节突关节切除诱发椎间盘退变的磁共振计量分析［J］.中国矫形外科杂志，2007，15（15）:11751177.

〔4〕 黄宗强，刘尚礼，郑召民.椎间盘退变的分子生物学研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2003，11（1）：5556.

〔5〕 Thompson JP,Oegema TR,Bradford DS.Stimulation of mature canine intervertebml disc by growth factors［J］.Spine,1991,16（3）:253260.

〔6〕 郑召民，刘尚礼，黄宗强.椎间盘再生研究进展［J］.中国矫形外科杂志,2003,11（5）:341342.

〔7〕 Nishida K,Kang JD,Gilbertson LG,et al.Modulation of the biologic activity of the rabbit intervertebral disc by gene therapy:an in vivo study of adenovirusmediated transfer of the human transforming growth factor beta 1 encoding gene ［J］.Spine,1999,24（23）:24192425.

〔8〕 Nishida K,Gilbertson LG,Robbins PD,et al.Potential applications of gene therapy to the treatment of intervertebral disc disorders ［J］.Clin Orthop,2000,379（Suppl）:234241.

〔9〕 黄宗强，刘尚礼，郑召民，等.携带人胰岛素生长因子1重组腺病毒的构建和鉴定［J］.中山大学学报（医学科学版）,2004,25（1）:4551.

〔10〕 黄宗强,刘尚礼,郑召民,等.转染hIGF1基因增强软骨细胞聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原的表达［J］.基础医学与临床，2005,25（5）:419423.

〔11〕 Paul R,Haydon RC,Cheng H,et al.Potential use of SOX9 gene therapy for intervertebral degenerative disc disease ［J］.Spine,2003,28（8）:755763.

〔12〕 季爱玉，胡有谷，谭江威，等.腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔腰椎间盘髓核细胞对蛋白多糖含量的影响 ［J］.中华骨科杂志,2002,22（10）:630634.

作者单位：郑州大学第一附属医院骨科，郑州 45005