【摘要】 目的 基于gltA基因序列的系统发育分析对云南巴尔通体的多样性进行分析。 方法 用云南省1999年至今分离到的并已在GenBank中公布的32个巴尔通体变异体（gltA基因）为目标株，利用网上核酸序列比对程序BLAST进行核酸序列同源性搜索,调出相似性最高且有效发表种典型菌株为对比株，进行比对和系统发育分析。 结果 32个巴尔通体变异体可归为B.elizabethae、B.tribocorum、B.grahamii、B.washoensis、B.taylrii、B.phoceensis和B.yunnannensis 7个分枝。同一枝中所有分离的变异体与其发育关系最密切且有效发表种典型的菌株间的gltA基因序列均有不同程度的差异。部分变异体与有效发表种典型的菌株间存在较大的遗传差异。 结论 云南巴尔通体菌不仅具系统发育多样性，而且还具有其特异性和可能有潜在的新种。一些不明原因的疾病有可能与巴尔通体的感染有关不容忽视。
【关键词】 云南； 巴尔通体； gltA基因； 系统发育分析
Analysis of phylogenic diversity of Bartonella in Yunnan Province.
YANG Fa-lian, BAI He-ming, YANG Hui.
( Yunnan Provincial Institute of Endemic Diseases, Dali 671000, Yunnan, P. R.China )
Abstract: Objective To investigate the phylogenic diversity of Bartonella in Yunnan Province,P.R.China, by using phylogenetic analyses based on gltA gene sequence comparisons. Methods The 32 variants (gltA gene) of Bartonella isolated in Yunnan Province and published in GenBank from 1999 to today were taken as the target strains. The most closely related typical strains searched by BLAST in GenBank with sequencing program were taken as comparative stains and their gltA gene sequences were compared each other. Phylogenetic analyses were performed after the multiple alignment of sequence data by ClastalX. Results The results showed that 32 Bartonella variants were belonged to seven branches including B.elizabethae, B.tribocorum, B.grahamii, B.washoensi, B.taylrii, B.phoceensis and B.yunnannensis. There sequences of the glrA gene of a variants in the same branch were, to a varied degree, diffenrent and hereditary variations were also noticed in some variants. Conclusion The Bartonella in Yunnan not only shows phylogenetic diversity , but also shows specificity and there may be a potential species. In addition, it may be possible that some unknown diseases might be associated with Bartonella infection.
Key words: Yunnan; Bartonella; gltA gene; Phylogenetic analysis
巴尔通体（Bartonella）是一新发现的古老病原体，迄今已发现21种及3个亚种,其中有9个种与人类感染密切相关[1，2]。因巴尔通体种类多，感染引起的疾病谱比较复杂，给人类健康带来巨大的威胁，日益引起国内外学者的关注。我国相关研究开展较晚, 1999年云南的白瑛等首次在鼠群中开展巴尔通体调查证实巴尔通体在云南普遍存在[3],至今已对16个县（市）进行了巴尔通体感染的调查。从黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠、斯氏家鼠、大绒鼠、齐氏姬鼠、中华姬鼠、大林姬鼠、小家鼠、锡金小鼠、灰麝鼩5个属的11个鼠种及其寄生蚤中先后分离到巴尔通体100多株[4，6]。其中近百株经巴尔通体gltA基因的379bp片断进行了序列测定,并提交基因库，所有菌株依基因结构可将它们分为32个变异体，并已在GenBank中公布。有些变异体仅包括1株菌，有些则包括来自不同地区同一宿主或不同宿主的多株菌。1种变异体中所含菌株数最多达15株[3]。为深入研究，现对已提交基因库并在GenBank中公布的云南32个巴尔通体变异体进行序列分析,结果如下。
1 材料和方法
1.1 菌株
1.1.1 目标株 云南1999年至今先后分离到的并已在GenBank中公布的巴尔通体变异体（gltA基因）为目标株。
1.1.2 对比株 利用网上核酸序列比对程序BLAST（美国国家生物技术信息中心，www.ncbi.nlm.nih.gov）进行核酸序列同源性搜索,调出相似性最高且有效发表种典型菌株为对比株。
1.2 gltA基因序列的系统发育分析 用ClastalX进行碱基配对及多序列比对，种系发生分析采用PHYLIP软件包中的Dnadist（Kimura两参数法）、Neighbor（邻系接合法），限制性种系发生的确信限度估计用100个拷贝由自助法完成。PHYLIP软件包中的距离基质法采用Seqboot、Dnadist、Neighbor和Consense软件。构建NJ系统进化树。
2 结果和讨论
2.1 GenBank中公布的云南巴尔通体变异体（gltA基因）的地区分布 云南从99年至今先后分离到的并在GenBank中公布的32个巴尔通体变异体分别来自宜良、保山、剑川、盈江、澜沧、龙陵和思茅 7县（市），分离自黄胸鼠（R.t.flavipectus）、褐家鼠（R.noruigicus）、大绒鼠（E.miletus）、齐氏姬鼠（A.chevrier）、中华姬鼠（A.draco）和大林姬鼠（A.peninsulae）6个鼠种及印鼠客蚤（Xenopsylla）和泸水栉眼蚤（Ctenophthalmus Lushuiensis）2种寄生蚤，见表1。
表1. GenBank中公布的云南32个巴尔通体变异体（gltA基因）的地区分布（略）
Table 1 TO publish 32 genetic variants of Bartonella in GenBank and Geographic distribution in Yunnan
可见巴尔通体在云南普遍存在，且在常见鼠群中广泛分布及高度流行。黄胸鼠和齐氏姬鼠为云南家、野两型鼠疫的主要宿主，巴尔通体感染与鼠疫之间有无联系?弄清这个问题对今后的疾病防治有着重要的意义。目前GenBank中公布的云南巴尔通体(gltA基因)有32个基因变异体，说明云南巴尔通体基因型别的多样性较丰富。
2.2 基于gltA基因序列的系统发育多样性分析 用Blast搜索软件从GenBank中进行相似性搜索，调出相似性最高且有效发表种典型的菌株的有效序列（表2），用ClastalX进行多序列匹配比对，然后用PHYLIP中相关软件进行系统进化树的构建（图1）。结果表明，32个巴尔通体变异体可归为7个分枝(RfLC84YN、RfLC04YN、RfLC80YN和RfLC40YN可归于B.tribocorum一枝,已报道[7],进化树在此未给出.)其代表菌株有效发表种分别为B.elizabethae、B.tribocorum、B.grahamii、B.washoensis、B.taylrii、B.phoceensis及云南单独存在的B.yunnannensis，曾报道[3]。32种变异体的归属和其gltA基因部分序列与其代表菌株有效发表种序列相似性分别为B.tribocorum（3个：Rf1563yn、RN10631LA和RfLC52YN，相似性均为96%）；B.tribocorum（8个：RN10 -149MD、RN10623LA、F47YN、Rf1570yn、RfLC40YN、RfLC80YN、RfLC84YN和RfLC04YN，相似性为99%～93%）；B.grahamii（8个：Ap1707yn、Ac1692yn、Ad1734yn、Ap1714yn、Rf1561yn、Rf1554yn、Ac1727yn和Ac1825yn，相似性为97%～93%）；B.washoensis（1个：Ac1826yn，相似性为97%）；B.taylrii（6个：Em1531yn、F16YN、F13YN、F14YN、F12YN和Em1712yn，相似性为97%～94%）；B.phoceensis（2个：Ap1699yn和Ac1693yn，相似性均为97%）；B.yunnannensis（4个：Rt222sm 、Ac1723yn、RfYJ41YN和Rn1691yn，相似性均为99%）。
图1 云南32个巴尔通体变异体及其从GenBank中调集的相关种构建的以gltA基因序列为基础的系统进化树（略）
Fig.1 Neighbor-Joining tree constructed showing the phylogenetic relationships 32 genetic variants of Bartonella in gltA gene sequences obtained from the Yunnan isolates and their closely related sequences downloaded from GenBank.
表2 云南32个巴尔通体变异体（gltA基因）与其系统发育关系最密切且有效发表种典型的菌株（略）
Table 2 Phylogenetic nearest neighbors and typical of strains and 32 genetic variants of Bartonella in yunnan by analysis of the gltA gene sequence
32个基因变异体大体可分为B.elizabethae、B.tribocorum、B.grahamii、B.washoensis、B.taylrii、B.phoceensis和B.yunnannensis等7个分枝，每一个分枝的代表菌株均是有效发表种，可见云南巴尔通体具有种类多样性。值得注意的是其中B.elizabethae、B.grahamii和B.washoensis[8]是已证实的人类致病菌，一些不明原因的疾病有可能与巴尔通体的感染有关不容忽视。同一枝中所有分离的变异体与其发育关系最密切且有效发表种典型的菌株间的gltA基因序列均有不同程度的差异。1 紫外分光光度计检测胶原吸收峰
经测定4种胶原最大紫外光吸收波长均在230 nm，形成一个较陡峭的峰，符合胶原蛋白特殊吸收峰波长位置，与文献报道的I型胶原特征相符［6］。
2.2 胶原氨基酸分析
氨基酸分析结果显示：所提4种胶原与sigma I型胶原在氨基酸组成上较相似，其中甘氨酸含量在30％左右，脯氨酸含量12％左右，含硫氨基酸(胱氨酸、蛋氨酸)含量较低，不含色氨酸(表1)。表1 胶原氨基酸分析结果
2.3 SDS-PAGE电泳
4种样品SDS-PAGE电泳显示3条明显条带，分子量大约是21.54×10-23 kg(两条)和109.36×10-24 kg (一条)kDa，符合文献报道的I型胶原蛋白分子2条αl(Ⅰ)链和1条α2(Ⅰ)链的组成特征。
2.4 提取率测定
本实验所提4种I型胶原样本的蛋白提取率，其中牛腱的提取率最高 (75.34％)，猪腱、猪皮的提取率其次，骨粉的提取率最低(6.24％)(表2）。表2 四种胶原的蛋白提取率
2.5 羟脯氨酸标准曲线的绘制（图1）
羟脯氨酸标准曲线，其线性回归方程为A=0.0081p+0.3233，相关系数R2=0.9485。说明该曲线的羟脯氨酸浓度和吸光度相关性好。
图1 羟脯氨酸标准曲线
2.6 纯度计算
根据测出的羟脯氨酸含量计算的四种I型胶原样本的纯度结果见表3，其结果显示经牛皮质骨所提胶原的纯度最高(96.12％)，其次为牛腱(87.50％)，而猪皮所提胶原含量则较低(76.25％)。表3 胶原纯度
3 讨 论
组织工程的发展得益于种子细胞、细胞因子和支架材料各方面的全面发展。而在骨组织工程的各个方面I型胶原都展现出其独特优点［7］。 I型胶原作为骨基质中含量最多的天然大分子物质，与骨的天然结构最接近，同时其种属特异性不强、抗原性低、亲水性好、生物相容性好等优点都使它在人工合成支架材料的改性［8］、细胞三维培养、细胞因子载药微球以及缓释技术等方面有着广泛的应用［9］。文献报道胶原在骨组织工程特别是人工骨组织工程方面应用较多的是表面修饰和改性作用：种子细胞对支架材料的粘附主要是通过细胞表面特异性整合素受体与材料中相应的配体结合而实现，单纯聚酯材料或无机支架缺乏此类配体，难以实现种子细胞的有效粘附；而I型胶原含有的特异性高效识别RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)肽序列恰恰具有整合素配体的特点，因而用其修饰能够增加细胞对支架材料的粘附，促进细胞的增殖和分化。
I型胶原制备的方法常规分为两大类。一类是利用基因重组合技术人工合成胶原，此类方法可以得到较高纯度的胶原产品，重复性好且质量稳定，但其成本高，工艺复杂，不利于推广。另一类是利用酸、碱、盐等化学物质从天然组织中提取胶原，此类方法工艺简便，成本低，但成分不均一，可重复性差。而且传统酸法或中性盐法所提胶原均为不完全交联的胶原［10］，其仅占组织中胶原总量的极少部分，而组织中含量巨大的交联胶原，由于溶解性差不能被有效提取。文献报道交联胶原的不溶性主要是由于胶原两端非胶原特异性结构域端肽的交联，而这些非特异性结构域易于被一些非特异性的酶 (如胃蛋白酶)所降解。基于以上原理，本实验采用限制性酶解法进行胶原制备：即使用胃蛋白酶降解胶原两端的结构域端肽，促进胶原溶解，实现高纯度、高效率的制备，同时此酶又不会破坏胶原的核心结构域(［α1(Ⅰ)］2α2(Ⅰ)三链结构)，确保了胶原的生物活性［11］。通过SDS-PAGE电泳、氨基酸含量分析和紫外最大吸收光波长证明本方法所制备的I型胶原性质符合文献报道，纯度高于Sigma公司产品。
本法所提胶原提取率的计算中，由于牛皮质骨中含有大量钙，其提取过程中需要脱除骨中钙质，所以牛皮质骨胶原提取率低于其他三种，但所获胶原纯度(96.12％)则明显高于其他，作为原材料大批量生产时，牛皮质骨成本明显低于其他几种、且容易获得，因此其相对较低的提取率是可以接受的。关于胶原纯度的计算，根据文献报道的羟脯氨酸不存在于普通蛋白中，仅存在于胶原、弹性蛋白及伸展蛋白中［12］，且在胶原蛋白中的含量为10％，因而可以通过羟脯氨酸含量的测定来计算胶原纯度。
综上所述，本研究采用限制性酶解法对4种生物原料进行胶原提取，通过该方法可以从牛皮质骨中获得高纯度的I型胶原，而从牛跟腱中提取胶原则可以获得较高的提取率。本实验的方法利于胶原批量产品开发，为组织工程及其他胶原相关产品的进一步深入研究、应用及开发提供了有力的实验研究基础。
【参考文献】
［1］ Gelse K,Poschl E, Aigner T. Collagens-strucure, function,and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews, 2003,12:1531 - 1546.
［2］ 田 丰,成国祥,刘长军,等.骨组织损伤修复生物医用材料的研究进展［J］.医疗卫生装备, 2005,2:22-23.
［3］ 徐俊华,王慧明.牛肌腱胶原蛋白的提取及多孔支架的制作［J］.中国口腔种植学杂志,2005,3:108-110.
［4］ Gogiel T, Bielecki DA, Bankowski E. Collagenous constituents of amniotic fluid［J］.Acta Biochim Poi,1998,4:1037-1046.
［5］ 赵苍碧,黄玉东,李艳辉.从牛腱中提取胶原蛋白的研究［J］.哈尔滨工业大学学报,2004,4:515-519.
［6］ Nagal T, Suzukin. Preparation and partial characterization of collagen from paper nautilus(Argonauta argo, Linnaeus)outer skin［J］. Food Chemistry,2002,76:149-153.
［7］ 陈大福,田 伟,行勇列,等.胶原支架增强自固化磷酸钙水泥的力学及成骨性能研究［J］.中国矫形外科杂志,2006,18:1410-1412.
［8］ 庞 龙,胡蕴玉,颜永年,等.骨组织工程快速成型支架改性的相关研究［J］.中华创伤骨科杂志,2007,8:730-734.
［9］ Friess W. Collagen-biomaterial for drug delivery［J］. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 1998,45:113-136.
［10］Kittiphattanabawon P, Benjakul S, Visessanguan W, et al. M. Characterisation of acid-soluble collagen fromskin and bone of big snapper (Priacanthus tayenus)［J］. Food Chemistry, 2005,89:363 - 372.
［11］Deyl Z, Miksik I, Eckhardt A. Preparative procedures and purity assessment of collagen proteins［J］. Journal of Chromatography B,2003,790, 1-2: 245-275.
［12］Mizuta S, Miyagi T, Nishimiya T,et al. Partial characterization of collagen in mantle and adductor of pearl oyster (Pinctada fucata)［J］. Food Chemistry, 2002,79:319 - 325.
作者单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所, 西安 710032