PAI-1 4G/5G基因多态性与严重急性呼吸综合征后骨坏死△

【摘要】  测定严重急性呼吸窘迫综合征（SARS）后骨坏死患者低纤溶倾向的纤溶酶原激活抑制物PAI和相关基因PAI-4G/5G基因多态性与国人SARS后骨坏死的关系，以便于非创伤性骨坏死的早期诊断和易感人群的筛选。［方法］取61例SARS后骨坏死患者抽取空腹肘静脉血。另取健康人群52名为对照，应用凝血仪、酶联免疫吸附（ELISA）方法测定PAI值，应用PCR+固相寡核苷酸连接分析（SPOLA）法测定PAI-1基因4G/5G多态性。［结果］SARS后骨坏死患者PAI异常明显PAI（1564±1385） U/ml VS（796±427） U/ml ，PAI-1基因4G/4G在骨坏死人群中增高，但统计学未见差异性，血浆PAI活性与4G/4G纯合子基因型密切相关。［结论］SARS后骨坏死患者的凝血指标异常，PAI可作为骨坏死易感因素的筛选指标。PAI-1基因4G/4G可能是国人骨坏死的遗传标记。

【关键词】  骨坏死 纤溶酶原激活抑制物

    Relationship between Post-SARS osteonecrosis and PAI-1 4G/5G gene polymorphisms∥SUN Wei,LI Zi-rong,SHI Zhen-cai,et alCenter for Osteonecrosis and Joint Preserving and Reconstruction,Department of Orthopaedic Surgery,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China

    Abstract ［Objective］To explore the correlation between and post-severe acute respiratory symptom(SARS) patients with osteonecrosis,investigate the etiology of post-SARS osteonecrosis,and select the sensitive molecular symbols for early diagnosis and distinguish the high risk population［Method］ The studied subjects were divided into two groupsTotally 62 post-SARS patients with osteonecrosis was one group,and 52 age and sex matched healthy people was as normal controlled groupEmpty stomach blood samples from cubital veins were collected from both groupsPlasminogen activator inhibitor(PAI) by means of evzyme linked immunosorbent assay(ELISA),and PAI-1 4G/5G polymorphism was detected by polymerase chain reaction PCR and Solid phase oligonucleotide assay(SPOLA)［Result］ The blood agents of post-SARS patients changed obviously with PAI-1 polymorphism detected in post-SARS group was more than that of the control group,but had no statistical significanceThe plasma PAI activity was related to homozygote 4G/4G genotypeThis reveals that homozygote 4G/4G genotype maybe a susceptible gene mark to Chinese osteonecrosis patients［Conclusion］ PAI-1 is sensitive blood symbol for screening high-risk susceptible population4G/4G PAI-1 genotype may be an etiological factor in osteonecrosis

    Key words：osteonecrosis;SARS;plasminogen activator inhibitor(PAI)

    非创伤骨坏死的发病机制中，各种潜在危险因子激活的血管内凝血使骨内血栓形成和骨坏死，有大量文献报道骨坏死的发生与患者的高凝低纤溶状态有关［1，2］。而纤溶酶原激活抑制物PAI及其因基4G/5G多态性在动静脉血检形成中起重要作用。作者对SARS后骨坏死患者的PAI及其基因4G/5G多态性进行检测，探讨其与骨坏死发生是否具有相关性，为骨坏死的早期诊断和干预提供理论基础。

    1材料与方法

    11临床资料

    在2003年春的SARS感染患者中，作者于2003年7月~2004年2月进行全身多关节（双髋、双膝、双踝、双肩、部分患者加双腕）MRI，CT及X线摄片等影像学普查，由放射科医师和专业骨科医师分别阅片，作出诊断，对两组诊断意见不一的资料，则共同阅片讨论，最后得出诊断。研究对象为61例发生骨坏死患者，其中男性25例，女性36例；平均304岁（20~60岁），激素（折合成甲强龙）使用量平均7 7064 mg（1 200-30 000 mg），每日最大剂量平均3732 mg（80~1 020 mg），使用激素时间平均408 d（14~105 d），平均冲击剂量时间（＞80 mg/d）301 d(9~67 d)，其中股骨头坏死50例87髋（单侧13例，双侧37例）；膝关节坏死35例63膝（单侧7例，双侧28例）；肩关节坏死15例24肩（单侧6例，双侧9例)；腕关节坏死4例7腕(单侧1例，双侧3例；舟骨7块、头状骨2块、月骨1块)，单纯累及骨干1例。对照组取正常健康人群52例，男性22例，女性30例，平均351岁(15~61岁)。

    12血液采集及处理

    取晨起肘部空腹静脉血8 ml／人，缓慢注入盛有38％枸橼酸钠的真空抽血管3 ml，EDTA抗凝管抽血管2 ml，抗凝剂与全血体积比为1∶9，轻轻混匀，两管室温下以2 500 r／min的速度离心15 min，收集上层液血浆。

    13PAl值的检测

    用凝血仪以酶联免疫吸附法(ELISA)测纤溶酶原激活抑制物(PAl)、全部血浆不需稀释，以Owem-Koller缓冲液校准为0％点，并检查校准曲线，每种检测指标分别设置质控，设制405 nm波长(vWF为540 nm、D-D为800 nm)读数，上机全自动操作。

    14全血DNA提取

    取含EDTA的抗凝全血300 μl，加入900 μl 5×STMT(按体积比1∶4灭菌双蒸水稀释)，温和混匀5~6次，冰浴10 min后，8 500 r／min离心30 s，弃上清。再加入300 μl  5 mol/L异硫精酸胍，温和振荡白色沉淀物后加入Rnase A 10 μl，室温放置10 min。加入800μl 4 mmol/L NaCLO4(PH52)和20 μl Resin(用时需充分混匀)，室温放置5 min，再次8 500 r／min离心30 s，弃上清。重复加入500 μl洗液混匀后，8 500 r／min离心30 s，弃上清两次。12 000 r／min离心60 s，吸干剩余液体，室温放置5 min，加入100 μl TE缓冲液，50 ℃保温10 min，12 000 r／min离心60 s，吸取上清，即为DNA。

    15PAI-1基因的扩增、杂交、标记和检测采用PCR加固相寡核苷酸连接分析技术(solid phase oligonucleotide assay,SPOLA)。

    151扩增

    用移液器在每个Lightcycler毛细管加入PCR mix(含PAI-1ampli-mix、引物和H2O)11 μl，5 μl样本DNA和11 μI SYBER Green I和阴性对照(5 μl H2O)放置在Roche PCR圆盘。设置实时荧光定量PCR仪94 ℃ 90 s→ 94 ℃ 15 s→ 63 ℃ 15 sec→72 ℃ 15 s×35个循环，4 ℃保存。

    152杂交

    毛细管离心后，各加5 μl杂交液(含PAI-1探针、缓冲液和H2O)，在突变对照和正常对照加10 μl杂交液，混匀后将毛细管内液分别移入检测板的WT孔和MUT孔各5 μl，室温孵育15 min。

    153连接

    每孔加入100μl标记液(含连接酶、缓冲液和H2O)，再次室温孵育15 min。

    154清洗与检测

    将液体倒出，每孔各加入100 μl洗液，清洗后吸干，加入酶标抗体100 μl，室温孵育15 min，清洗2次再加入底物100 μl，室温孵育30 min加终止液。

    155结果判断

    设置酶标仪405 nm，测定各标本OD值，按照公式R=OD(WT)／OD(MUT)，校准正常对照≥268，变异对照≤032。推算按R≥268为 5G／5G，R≤032为4G／4G，039≤R≤158为4G／5G。

    16统计学处理

    所有数据以均数±标准差表示，应用SAS 612和SPSS 110统计处理软件包，由于大多数数据为非正态分布，采用Wilconxon非参数检验比较SARS后骨坏死组和对照组的差异。采用方差分析分别对骨坏死组和对照组PAI-1基因型和对应PAl值进行分析。P<005为差异有显著性。

    2结果

    SARS后骨坏死患者低纤溶倾向明显，PAI升高1564±1385 U／ml而对照组仅为796+427 U／ml；PAI-1的4G／4G基因型较对照组多见，但无统计学差异，4G／4G基因型对应患者4G／4G的血浆PAI易出现增高，说明PAI基因与血浆PAl活性有一定相关性(详见表1、2和图1)，但在对照组不同基因型对应的PAI值无显著性差异。

    表1PAI-1 4G／5G基因型和等位基因频率分布分组例数4G/4G4G/5G5G/5G等位基因频率4G5G对照组5213（250%）27（519%）12（231%）53（510%）51（490%）骨坏死组6123（377%）22（361%）16（262%）68（557%）54（444%）经：卡方检验P＞005

    3讨论

    近年来，对骨坏死和凝血、纤溶系统异常的关系越来越受到重视。大量的研究表明非创伤性骨坏死与凝血纤溶紊乱有密切关系［3~5］，血管内凝血导致在软骨下微循环的纤维蛋白和血小板血栓形成，引起骨内高压，血流减少，骨细胞的缺血缺氧，最后出现骨细胞的死亡。Starklint等［6］在骨坏死区域发现纤维蛋白血栓，为这一理论提供了证据。高凝和低纤溶倾向可以是先天遗传或后天获得的，SARS骨坏死患者由于激素使用等原因，血液呈高凝和（或）低纤溶状态，导致最后骨内血循环血栓形成，产生骨坏死。激素治疗会使患者处于“血栓前状态（prethromobotic stage)”，即能导致血栓形成的异常因素而构成的血栓形成前的病理状态，患者如果本来存在高凝和低纤溶倾向，在激素治疗时将有更大的风险，产生易栓症，出现骨坏死，这就是骨坏死的二次打击理论(second hit theroy)。

    表24G/5G基因型和等位基因频率分布及

    与血浆PAI-1活性的关系分组基因型PAI值（U/ml）对照组4G/4G1031±6664G/5G748±2955G/5G650±247骨坏死组4G/4G2087±18254G/5G1490±1028*5G/5G913±654*△注：骨坏死组各基因型对应的PAI值两两比较*P＜005，△P＜005骨坏死组PAI均数图：

    图1为5G/5G，2为4G/5G，3为4G/4G，说明PAI值随4G等位基因出现频率增多而增高

    纤溶系统是纤溶酶原转变成有纤溶活性的纤溶酶和作用于纤维蛋白过程中有关的作用物、底物、激活物和抑制物。纤溶过程是一系列蛋白催化的连锁反应，其主要作用是使体内所产生的局部或一过性的纤维蛋白凝块随时得到溶解，从而防止血栓形成。其中纤溶酶原激活物抑制剂PAI主要由血管内皮细胞产生，属丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，主要通过灭活组织纤溶酶原激活物的活性起作用，其活性增高见于高凝和血栓性疾病。纤溶系统异常和骨坏死的关系在许多研究中发现，Glueck［7、8］报道了PAI与骨坏死的相关性，本研究SARS后骨坏死组PAI明显增高，支持这一结论。

    人类PAl-1基因位于第7号染色体q213～q22，有9个外显子和8个内含子，近年来的研究发现PAl-1启动子区若在转录开始部位上游的675bp处，插入(缺失）一个碱基(鸟苷G)，形成一种4G／5G多态性，临床观察显示4G／5G多态性与血浆PAI-1活性有密切相关性，4G等位基因会导致血浆PAI-1升高。Glueck［9］研究中，59名骨坏死患者中41％为4G／4G纯合子，对照组仅有20％，认为PAI-1基因多态性是骨坏死的致病因素。Paolo［10］对肾移植术后出现的骨坏死的病人进行PAI-1基因的检测，发现4G／4G基因型出现频率明显高于无骨坏死组，认为4G／4G基因型可作为肾移植术后骨坏死的预测指标。而最近Asano［11］发现PAI-1基因多态性与日本人肾移植后骨坏死无相关性，认为有种族差异。

    作者的研究发现SARS后骨坏死人群中4G等位基因较对照组增多，但没有统计学上的差异，可能与研究例数尚少，统计方法所限有关，但对应的血浆PAI水平在4G／4G基因型明显高于其他两种基因型，说明骨坏死PAl增高与4G／4G基因型有相关性。这说明PAl可作为骨坏死易感因素的筛选指标，PAl-1基因4G／4G可能是国人骨坏死的遗传标记，这些发现均说明PAl及PAl-1基因4G／4G在非创伤性骨坏死的高危易感人群的筛选中有重要价值。

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［10］Paolo F, Verena S, Suzanne A, et al Association of plasminogen activator inhibitor-1 genotype with avascular osteonecrosis in steroid-treatment renal allograft recipients［J］Transplantation，2002,74: 1147-1152

［11］Asano T, Takahashi KA, Fujioka MRelationship between postrenal transplant osteonecrosis of the femoral head and gene polymorphisms related to the coagulation and fibrinolytic systems in Japanese subjects［J］Transplantation，2004,77:220-225

作者单位：北京中日友好医院a骨科骨坏死与关节保留重建中心b检验科，北京100029