周围神经再生研究方法的进展

【关键词】  周围神经损伤

    1  常规周围神经再生检测方法及现今发展的方向

    神经行为学及神经电生理学。这两种检查方法简单方便，也是临床上常用的检测神经再生的方法，但均是反应神经功能的间接指标，所以出现阳性结果时间较晚，不能很好地及时地反应神经真正的再生情况［1、8］。

    现今研究神经再生的动物实验常用组织形态学的检查及利用示踪剂进行轴突的示踪，从而能直接地观察到神经形态上变化，了解神经轴突的生长情况，判定神经的再生程度。神经再生从微观来看，组织结构上为轴突的再生，功能上为轴浆流运输的恢复，运送神经递质到靶器官；大体来讲，神经再生在结构上为神经纤维连续性的恢复，外形光滑完整，功能上为运动及感觉的恢复。

    2  传统的组织形态学研究周围神经再生

    周围神经组织形态学研究的基础是神经的解剖结构。从解剖学上讲神经系统的基本结构是神经元和神经胶质。神经元由胞体和突起两部分构成，神经元较长的突起和其外表包被的结构称为神经纤维。较大的神经元轴突常被附近的神经胶质或雪旺氏细胞卷绕包裹形成髓鞘，可保证轴突能高速传导生物电信号。解剖上神经元有长短不等的轴突，轴突由轴索及表面的髓鞘构成。轴突的外面由神经内膜覆盖。轴索、髓鞘、神经内膜组成了完整的神经纤维，多个神经纤维组合在一起形成神经束，表面包绕神经束膜。多条神经束形成神经干，表面是神经外膜。组织形态学检查是对神经再生结构恢复的研究。研究神经再生形态学传统的方法是对再生的神经组织结构直接染色成像。包括HE染色，乙酰胆碱酯酶染色，免疫组化染色(抗神经丝单克隆抗体进行标记，然后呈色反应)，甲苯胺蓝染色等。采用HE染色(苏木精-伊红)染色方法，直接观察再生神经的有髓纤维(轴突)的数目；乙酰胆碱酯酶染色，可以区分运动及感觉神经纤维轴突数；抗神经丝单克隆抗体进行标记，然后呈色反应、免疫组化染色，直接观察再生的神经纤维［10］。传统的方法是对再生神经组织结构的静态研究，可以通过染色直接观察再生的神经纤维及轴突的形态及数目［8，17～19］。

    3  通过神经示踪剂进行轴突示踪研究周围神经的再生

    研究神经再生的基础是神经轴浆流的运输。神经元产生的营养物质运输至轴突及其分支以维持其代谢，在神经末梢释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末梢也有影响细胞代谢的物质逆向转运至胞体，这种运输现象称为轴浆(突)运输。轴突运输是反映神经结构、功能和代谢完整性的重要指标。周围神经损伤段轴浆流运输的恢复是神经再生的最初证据［8］。

    目前动物实验中应用最广泛的研究神经再生的方法是利用神经元轴浆运输现象的示踪法，也就是动态研究神经再生的情况。神经示踪剂通过顺行及逆行运输用来研究轴突的传导路径，研究神经元之间的纤维联系及神经再生的情况。    现有的研究再生神经轴突运输，神经形态学的检测方法归纳如下。

    3.1  辣根过氧化物酶示踪技术(HRP示踪)

    HRP被神经组织摄入后，顺向或逆向运输，然后用组织化学方法显示HRP的运输结果为HRP示踪。

    辣根过氧化物酶能被神经末梢摄取，经周围神经的轴突运输，并参与神经细胞的代谢。HRP注入肌肉被神经末梢摄取后，经轴浆逆流可以通过神经缝合口到达神经近段；HRP也可以被胞体摄入并顺向送至终末部。常规的HRP示踪为联苯胺法或TMB法。将HRP注射到神经的一定部位，经过固定及切片，用联苯胺法显示标记的结果。由于HRP参与细胞代谢，所以缺点是在细胞内存留的时间短［15，20］。

    3.2  放射性核素示踪(放射性核素标记氨基酸或HRP)

    (1)实验选用发射γ射线的125I为标记物，标记酪氨酸

    酪氨酸参与神经细胞的营养代谢，将标记的酪氨酸直接注入神经干内，标本以γ-计数器进行测量，方法简便，为将来临床应用131I进行检测提供了实验基础。实验结果显示，在大鼠坐骨神经干内注射125I-酪氨酸，随着轴浆流的运输通过神经吻合口。放射性核素标记的氨基酸是轴浆流体内检测实验研究较好的实验模型。具有标记方法简便、可靠，注射方法简单，吸收时间和转运速率均适中的优点［1］。

    (2)HRP方法与放射性示踪剂(125I)联合应用。125IHRP注入肌肉被神经末梢摄取后，经轴浆逆流可以通过神经缝合口到达神经近段，应用Γ-计数器可探测神经组织中的125碘放射性强度。研究125碘-辣根过氧化物酶(125I-HRP)追踪术后神经轴浆流的可行性，为临床应用放射性同位素研究神经再生提供实验依据。实验中，将125I-HRP注入大鼠小腿三头肌后，切取其坐骨神经组织进行放射性强度的r计数，能判断神经再生的程度［3］。

    实际上，随着同位素标记技术的提高和同位素检测设备的改善，对微量放射性已能检测，进行同位素标记物质随轴浆流转运的体内检测也已有可能，并有可能成为临床上检测神经再生的重要手段。

    3.3  顺行示踪技术(生物素葡聚糖胺BDA、病毒追踪法)

    BDA追踪法的优点：能长距离运输，可双向运输，因而局部注射后有利于观察结果。在中枢神经系统的解剖学研究中，BDA染色能非常清晰地显示轴突，反应程序简单，灵敏度高。BDA染色后，可与荧光追踪剂联合使用，便于在荧光显微镜或共聚焦显微镜(LSCM)下观察。BDA与卵白素(阿维丁，avidin)之间有特别强的亲和力，常用结合过氧化物酶或荧光素的avidin与之孵育结合，通过组化反应或荧光显微镜观察标记结果。葡聚糖用于顺行追踪时能充分显示轴突及其分支［8］。

    通过大鼠的实验研究，10％BDA可清晰地在周围神经轴突内显像，操作简单，结果易于观察。BDA神经干局部注射后能较清楚而直观地显示局部轴突运输的情况。BDA注射点：经DAB显色见标记阳性的神经纤维呈褐紫色标记，有髓神经纤维较粗。共聚焦显微镜观察，BDA注射点见髓鞘荧光信号较强，髓鞘被均匀染色，高倍镜下局部注射点处的神经纤维纵切片可见神经纤维的轴突、髓鞘、神经被膜均有明显的荧光标记。髓鞘染色，轴突亦染色，髓鞘与轴突界限明显。其标记物主要位于轴突且标记明显，而髓鞘的标记不明显［5］。

    3.4  荧光素示踪(荧光素，荧光金)可以和HRP、免疫组化等方法结合

    3.4.1  荧光剂示踪  神经纤维进行示踪研究的过程中，人们使用过多种染料，如DiI、快蓝、荧光金等。荧光金在波长为323 nm的紫外光激发下，可发出波长为408 nm的黄色荧光，且具有灵敏度高、运输和标记的距离长，标记细胞浆的同时不标记细胞核，可耐受多种组织染色处理的特性，被越来越多地应用于逆行示踪的研究。同时对轴突也有很好的标记效果。分布均匀，呈线性荧光，有利于对轴突形态的直接观察。FG(荧光金)可在细胞内长期存留，不能跨突触运输。现有学者用荧光金逆行示踪技术评价大鼠正常及视神经不完全损伤后的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的数目［7］。DiI、快蓝等染料在神经再生的示踪中在国外的文献中也有大量报导［9，12，13］。

    3.4.2  荧光双标  通过荧光双标研究神经吻合后轴突再生的情况，探讨神经端侧吻合后轴突再生的来源，及供神经外膜开窗与否对轴突再生的影响。将2种不同的荧光素(FB、NY)分别注入端侧吻合远侧的供、受神经内，通过轴浆逆行运输到供神经的神经元，FB标记胞浆，NY标记胞核。由于NY是注射到受神经，只要供神经的神经节细胞的胞核被标记，就说明供神经的轴突长入于受神经。只要供神经的胞核、胞浆均被标记，就说明有供神经侧枝发芽长入受神经。因此，胞核单标记或胞核、胞浆双标记，对证明供神经轴突长入受神经，在意义上是相同的［16］。

    3.4.3  与免疫组化等方法结合  例如ABC法，结合HRP复合物或FITC(异硫氰酸荧光素)等荧光素的抗生物素与生物素有很强的亲和力，反应后进行标记，可以与BDA法相结合应用［8］。

    3.5  分子神经生物学方法

    通过腺病毒介导的LacZ基因靶向性导入脊髓及示踪周围神经的动态过程。由损伤的周围神经导入的AdLacZ不但在靶神经元高效特异性表达，而且能高效顺行标记神经元突起、周围神经直至吻合口远端的再生轴突，这对周围神经损伤的基因治疗和神经示踪研究有实用价值。也是反应神经轴突运输的动态过程［6］。

    4  在体微创周围神经再生研究

    由于行为学及电生理的检测不够准确、及时，神经形态学及神经轴浆流的一些示踪检查都需要切取组织切片检查，这些研究对于临床观察神经再生不实用，离作者的目标还差很远。所以出现了一些对于神经再生进行无创的在体实验研究，包括以下几个方面：

    （1）以131I-酪氨酸在神经内的在体示踪显像，结合99Tcm-MDP骨显像

    选用131I酪氨酸和99Tcm2亚甲基二膦酸盐(MDP)，通过计算机图像融合，在兔动物模型中，分别对正常坐骨神经及移位后膈神经进行轴浆流核素显像。结果表明正常兔坐骨神经内轴浆流转运速率为每天30 mm，膈神经移位术后1个月即可在再生良好组织中测出131I酪氨酸通过吻合口向远端转运，转运速率为每天40 mm。在瘢痕组中发现131I酪氨酸不能向远端转运。131I酪氨酸在神经内的转运可用于在体示踪显像，与99Tcm2MDP图像融合可对转运图像进行定位，可在术后早期在体直观检测轴浆流通过神经吻合口的能力。但不能得到神经纤维满意的图像［2］。

    （2）经皮在解剖荧光显微镜下可观察转基因实验大鼠表达荧光蛋白的皮神经的形态及再生的情况［10，11］。

    （3）美国最新的神经再生方面在体研究是通过神经纤维局部注射荧光剂，然后利用微导管共聚荧光显微镜直接观察神经纤维的图像，了解周围神经再生的局部情况。为了更加准确地反应周围神经功能的恢复情况，实验同时增加功能核磁的观测大脑皮层指标来反应神经系统总体的恢复情况也就是间接地反应了神经功能的恢复。这两种检测方法结合到一起，既有解剖上的观察，又有功能上的检测，可以更全面客观地反应神经再生的情况，而且将检查的损伤降到最低水平。但此研究仍处于动物实验阶段［14］。

    近年来对周围神经再生的研究虽然取得了重大的进展，可以通过神经轴浆流的运输较早地准确地反映神经再生的情况。但所有的研究多偏重于基础研究，对于神经的标记方法、注入途径及放射线和荧光特性均难以适应临床应用的要求，无法过渡到人体在体的检测。我们的目的就是通过大量的研究将目前人体周围神经再生的情况，能够真实地呈现在学者的面前。通过特殊的检查或仪器，可以清楚地观察到肢体神经损伤后，神经纤维生长的情况，以及从分子水平了解神经再生的影响因素，这是一个非常长期的、非常艰难的研究课题，也是我们未来研究的方向［2１～23］。

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作者单位：北华大学附属医院手外科，吉林市 132011