Experimental Research肩袖撕裂病人肩峰下滑囊顶部的组织学变化

【摘要】  ［目的］观察肩袖撕裂病人肩峰下滑囊（subacromial bursa, SAB）顶部的组织学变化。［方法］在肩袖撕裂病人修复手术中，分别取撕裂处和远离撕裂处SAB顶部，采用组织学、免疫组织化学和电镜观察上述两处SAB的形态学变化，通过计算机图像分析系统对SAB切片的细胞数量进行定量评价，并与正常SAB比较。［结果］实验组所有肩袖撕裂病人SAB顶部，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见细胞数量和血管分布的增加，细胞数量显著高于正常SAB (P<0.05)，且均未观察到炎性细胞浸润。肩袖撕裂的不同类型、SAB的不同增厚程度以及SAB是否积液，SAB细胞数量无显著性差异。超微结构可见到以B型细胞为主，细胞狭长。免疫组织化学染色也证实肩袖撕裂病人SAB顶部主要系B型滑膜细胞。［结论］肩袖撕裂病人SAB顶部的细胞数量的增加是一种反应性的增加，而不是真正的炎症，而且这种反应是广泛性的。SAB的变化系肩袖撕裂引起的继发反应。

【关键词】  肩关节； 滑囊； 肩袖

    Morphological changes of the roof of the subacromial bursa after rotator cuff tear∥ZHU Jinyu, LV Hongsheng, ZHU Qingsheng, et al.Institute of Orthopaedics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

    Abstract：［Objective］To investigate the morphological changes of the roof of the subacromial bursa and the extent of involvement of the subacromial bursa after rotator cuff tear. ［Method］For the experimental group, the roof of the subacromial bursa was obtained from patients with rotator cuff tear both at the tear site and 2.5 to  3.0 cm distal to the tear site during surgery of rotator cuff repair. For the control group, the roof of the subacromial bursa was obtained during surgery of recurrent shoulder dislocation or humeral shaft fracture at the exposure site. The specimens were processed for histological staining, immunohistochemical analysis and for transmission electron microscopy. The number of cells were quantitated by counting cells with blue-stained nucleus in the subacromial bursa using a computer image analysis system. ［Result］The number of cells increased significantly in the roof of the subacromial bursa obtained from both sites, the tear site and the distal site, in the patients with rotator cuff tear, compared with the normal bursa (P<0.05 by ANOVA). However, there was no difference in the bursal reaction among the rotator cuff tear type, the bursa thickness and the presence of fluid in the bursa. The great majority of cells were type B cells observed under transmission electron microscopy and confirmed by immunohistochemical analysis. ［Conclusion］The increase in cellularity in the roof of the subacromial bursa of patients with rotator cuff tear is a reaction rather than an inflammatory process and the involvement of the subacromial bursa is not limited in extent. The reaction of the roof of the subacromial bursa is secondary to the rotator cuff tear rather than primary cause of the rotator cuff tear.

    Key words：shoulder joint；  bursa；  rotator cuff

    慢性肩关节疼痛是第三大最常见的肌肉骨骼系统疼痛，发病率为6.65%～25%，是老年人的常见病和多发病［1］。肩袖撕裂是慢性肩关节疼痛的主要病因之一。据统计60岁以上老人10%～20%有肩袖撕裂。尸检证实60岁以上死亡者30%肩袖全层撕裂［2］。肩袖撕裂病人肩关节剧烈疼痛，尤其是夜间疼痛加重，无法休息，还伴有肩关节活动受限，严重影响工作和生活，给许多老年患者带来了极大的痛苦，也给家庭和社会增添了很大的负担。肩袖撕裂是内在因素和外在因素共同作用的结果，即不单纯是某一原因所致。内在因素包括肩袖肌腱的乏血管区和冈上肌腱的特殊位置和功能；外在因素包括肩关节反复应用，肩峰下撞击和不同程度的肩关节外伤。

    肩峰下滑囊（subacromial bursa, SAB）是人体最大的滑囊，介于三角肌深面与喙肩弓及肩肱关节外侧面之间，上为三角肌、肩峰及喙肩韧带，底为冈上肌腱与关节囊融合部［3］。SAB在肩袖撕裂中的作用尚存在争议，本实验在肩袖撕裂病人修复手术中，分别取撕裂处和远离撕裂处SAB的顶部组织，采用组织学、免疫组织化学和电镜观察上述两处SAB形态学和超微结构的变化，并与正常SAB比较，以明确SAB顶部的变化是肩袖撕裂的原因还是结果，以及这种反应是局限性还是广泛性的。

    1  材料和方法

    1.1  临床资料

    本实验分为实验组和对照组。实验组包括30例肩袖撕裂的病人，其中男20例，女10例，平均61.6岁(37～77岁)。14例有外伤史。工人、管理人员、职员和无职业者分别占11、3、 6和10例。病程最长10年，最短1周，平均病程为12.7个月。对照组包括8例复发性肩关节前脱位或肱骨干骨折的病人。

    1.2  手术取材

    所有的手术均采用半坐位（beachchair沙滩椅体位）在全麻下进行。实验组经肩峰入路显露肩袖，采用肌腱对肌腱缝合或McLaughlin法修复撕裂的肩袖。在肩袖的撕裂口处以及距撕裂口2.5～3 cm处（称为远隔部位）分别取1.5 cm×1.5 cm左右的SAB顶部组织（3例肩袖球形撕裂的病人因为撕裂范围太大，仅取了撕裂口处的SAB）。 对照组在复发性肩关节前脱位或肱骨干骨折术中切口附近取SAB顶部组织。对SAB的增厚程度分为正常、轻、中、重加以纪录，同时记录SAB内有无积液、肩袖撕裂的种类等。

    1.3  标本处理

    每1例标本分为2部分，大部分立即经10%中性福尔马林固定，石腊包埋，切片厚度为3 μm，常规进行苏木精-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色。余下的小部分标本，用手术刀片切成约1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm大小2～3块, 立即浸入2.5%戊二醛水溶液内固定, 经逐级脱水包埋, 超薄切片, 在JEM2 000EX透射电镜(JEOL公司, 日本)下观察SAB的超微结构。

    1.4  免疫组化染色

    采用SABC方法，石蜡切片(厚3 μm) 逐级脱蜡入水，PBS 缓冲液洗，分别经PBS、双氧水阻断内源性过氧化物酶(37 ℃湿盒)，胰酶消化10 min(37 ℃湿盒)，正常山羊血清封闭10 min (37 ℃湿盒)，滴加一抗小鼠抗人Vimentin抗体(武汉博士德) 后4 ℃过夜。第2 d复温后经生物素化二抗(37 ℃湿盒30 min)、SABC(室温湿盒30 min)，DAB 显色。分别以山羊血清和PBS取代第一抗体作替代对照和空白对照。阳性结果为棕黄色表达。

    1.5  形态计量学

    采用计算机图像分析系统对SAB顶部中胞核兰染的细胞进行计数定量分析。数码像机(model PDMC2, Polaroid公司,美国) 连接在奥林帕斯显微镜(model BX40, Olympus 公司, 日本)。经宝丽莱PDMC 1e软件 (v1.25, Polaroid 公司, 美国)在40倍物镜下随机采集图像。每一张切片共采集7～12个区域，每一个区域面积为0.0432 mm2。用Scion Image for Windows (Beta v4.02, Scion Image for Windows 是美国国立卫生研究院编写的NIH Image的Windows 版本)图像分析软件对SAB切片胞核兰染的细胞数进行定量评价。

    1.6  统计学分析

    统计数据用均数±标准差（Mean±SD）表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两样本均数间比较用t检验， P<0.05为有显著性差异。

    2  结  果

    2.1  大体观察

    按照日本信原病院的分类标准［4］，30例肩袖撕裂病人中球形（global）、三角形（triangular）、隐蔽性（concealed）和纵行（longitudinal）撕裂分别占7、7、6和4例，其它还有前方（anterior）和滑囊面（bursa side）撕裂各2例，后方（posterior）和巨大（massive）撕裂各1例。术中肉眼观察所见，SAB正常、轻度、中度、重度增厚分别为11、7、10和2例。19例SAB内无积液， 11例SAB基底部破裂而与盂肱关节腔相通而有不同程度的积液。而对照组SAB色泽和厚度正常，也无积液。

    2.2  组织学观察

    在实验组所有肩袖撕裂病人SAB顶部组织，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见细胞数量和血管分布的增加。而正常对照组病人SAB顶部，细胞数量和血管分布均很少。实验组和对照组均未观察到炎性细胞浸润（图1, 2）。

    2.3  超微结构

    实验组肩袖撕裂病人SAB顶部组织，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见B型细胞占据绝大多数，细胞形态狭长，仅见到很少量的A型细胞。而正常对照组病人SAB顶部，A、B两型细胞分布较为均匀（图3）。

    2.4  免疫组化染色

    实验组所有肩袖撕裂病人SAB中绝大多数细胞均可见到Vimentin阳性表达。正常对照组SAB中Vimentin阳性表达很少（图4, 5）。

    2.5  形态计量学

    2.5.1  实验组和对照组SAB细胞数量的比较   结果表明，实验组肩袖撕裂病人撕裂处和远隔处SAB顶部的细胞数量分别为121.2±32.1、118.9±28.4，两者无统计学差异。正常对照组病人SAB顶部的细胞数量为61.4±4.5，与实验组撕裂处和远隔处SAB顶部的细胞数量比较均有显著性差异（P<0.05）（表1）。

    图1  肩袖撕裂病人撕裂部位SAB 顶部，可见细胞数量和血管分布的增加。（HE×200）

    图2  正常对照组病人SAB顶部，可见  细胞数量和血管分布均很少。（HE×200）  图3  肩袖撕裂病人撕裂部位SAB顶部以B型细胞为主，可见许多粗面内质网池（×7.5）  图4  肩袖撕裂病人撕裂部位SAB顶部，绝大多数细胞均可见到Vimentin阳性表达。（SABC×400）  图5  正常对照组病人SAB顶部，可见Vimentin阳性表达很少。（SABC×400）表1  实验组和对照组SAB细胞数量的比较*P<0.05 与对照组比较

    2.5.2  不同类型肩袖撕裂病人SAB顶部细胞数量的比较  无论是球形撕裂、三角形撕裂、隐蔽性撕裂或纵行撕裂，不同类型肩袖撕裂病人之间SAB顶部细胞数量的比较无统计学显著性差异（表2）。 表2  不同类型肩袖撕裂病人SAB细胞数量的比较

    2.5.3  不同程度增厚的SAB顶部细胞数量的比较  不同程度（正常、轻度和中度）增厚的SAB之间细胞数量无统计学显著性差异。重度增厚仅为2例，故无法作统计学处理，但是从数值上看，与其它不同程度增厚的SAB未见明显差别（表3）。 表3  不同程度增厚的SAB细胞数量的比较

    2.5.4  SAB是否积液细胞数量的比较  统计学分析表明，无论SAB是否积液，SAB顶部的细胞数量无显著性差异（表4）。表4  SAB是否积液细胞数量的比较

    3  讨  论

    SAB在生理状态下提供了一个滑动的机制［5］。一般认为SAB与肩关节疼痛有关［6］。对于SAB在肩袖损伤中的作用尚存在争论。有学者认为SAB是肩袖撕裂的原发因素之一［7］，SAB的炎症波及到冈上肌及其它肩袖组织，导致了肩袖的撕裂［8］，有实验也证实原发性的肩峰下滑囊炎可引起冈上肌腱的继发改变［9］。但是更多的学者则认为肩袖撕裂引起SAB继发反应，SAB的变化是肩袖撕裂的结果而不是原因，此时SAB是一种反应而不是炎症［10～12］。SAB在肩袖修复过程中有重要的作用，故术中应尽量保留SAB而不能随意切除［13～15］。由于SAB在肩关节疾病具有重要作用，它一直是肩关节外科的研究热点。但是对于肩袖撕裂病人SAB顶部的组织学和超微结构研究，尚未见类似文献报道。

    Ishii等［12］研究了肩袖撕裂、肩峰下撞击征和钙化性肌腱炎病人的SAB，部分肩袖撕裂的病人同时取了撕裂部和距撕裂口2.5 cm处的SAB组织，发现撕裂部位SAB均存在不同程度的反应，包括细胞数量和新生血管数量的增加，血管周围Ⅲ型胶原形成；而距撕裂口>3 cm处的SAB大部分正常或反应轻微。本实验研究了肩袖撕裂病人SAB顶部的变化，发现在实验组所有肩袖撕裂病人的SAB，不管是取自撕裂部位还是远隔部位，均可见细胞数量和血管分布的增加，细胞数量显著高于正常SAB，且均未观察到炎性细胞浸润。组织学表现支持这是一种反应性细胞数量的增加，而不是真正的炎症，而且这种反应是广泛性的。而且肩袖撕裂类型不同，也即意味着累及的肌腱、肩袖撕裂的大小均有差别，SAB增厚程度不同，不管SAB内有无积液，SAB顶部的细胞数量都无显著性差异，均提示反应的广泛性。因此，本实验在肩袖撕裂部位SAB得到的结果与Ishii等的报道相似，但是在远隔部位SAB得到的结果与Ishii等的报道不同。原因之一可能在于取材部位的不同，本实验是从SAB的顶部取材，而Ishii等未说明是从SAB的顶部或基底部取材。SAB顶部很容易与覆盖在上面的肌肉分离，但其底部与下方的腱周结缔组织紧密结合，肩袖撕裂病人SAB的顶部或基底部可能会存在不同的反应。原因之二是实验方法的差异。本实验采用计算机图像分析，较客观的计数了SAB细胞数量，而Ishii等用两个独立的病理学者来观察SAB的反应，尽管2人观察的一致性较高，但不可避免存在主观性。

    Sarkar等［16］报道SAB可见到A、B 2型细胞，A型细胞类似吞噬细胞，表面有长丝状伪足, 胞质空泡较多，还有溶酶体和许多线粒体，核周围有许多高尔基器。B型细胞类似成纤维细胞，可见许多粗面内质网池。波形蛋白丝(Vimentin filament）主要存在于成纤维细胞和来自胚胎。B 型滑膜细胞来源于滑膜内层或滑膜下层的干细胞，其胚胎学来源是中胚层的肢芽原始间充质细胞，是在局部组织表面的微环境的作用下分化而成，Vimentin 是中胚层组织细胞的特征性蛋白。本实验免疫组化染色和超微结构均证实肩袖撕裂病人SAB的顶部以B型滑膜细胞为主，提示肩袖撕裂病人SAB以修复过程为主。Szomor等［17］采用RTPCR检测了肩袖撕裂病人SAB内多种细胞因子的表达，结果提示肩袖撕裂病人SAB以修复过程为主，或者说是对机械刺激改变的反应，而不是炎症或破坏性过程。

    细胞数量和形态的变化还可能与肩峰下压力的增加有关。正常肩峰下存在压力，随着不同的活动范围而改变。肩峰下静息压力1.1 kPa，肩主动前屈45°上升至5.2 kPa［18］。肩袖撕裂的病人由于失去了肩袖对肱骨头的压力，肱骨头可不同程度的向上移位而导致肱骨头和肩峰之间的间隙缩窄；而且肩峰下往往形成骨赘，导致肩峰下间隙更加狭窄，SAB内压力必然会上升。因此作者推论肩袖撕裂时肩峰下压力包括SAB内的压力升高。从生物力学角度来说，生长和重建受应力之类的力学因素调节［19］，即应力(应变)决定着生长、重建，而形态又决定于其力学环境［20］。所以，肩袖撕裂病人的肩峰下存在广泛的反应，而且细胞形态变得狭长。

    　　本实验研究了肩袖撕裂病人SAB顶部的变化，证实SAB的变化系肩袖撕裂引起的继发反应，是一种反应性细胞数量的增加，而不是真正的炎症，而且这种反应是广泛性的。但是SAB底部的变化是否与顶部的变化一致，这正是作者下一步实验要解决的问题。

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作者单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所，西安 710032