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【摘要】 ［目的］本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞（ADSCs），观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分：Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage, ColⅡ)和aggrecan的合成，为构建新型的组织工程软骨提供实验依据。［方法］TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选; RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FN)、ColⅡ、Aggrecan的表达； Western -blot检测TGF-β1。［结果］RT-PCR结果显示：实验组（TGF-β1稳定转染组）的TGF-β1、FN、ColⅡ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多（P< 0. 01）；Western blot检测实验组（TGF-β1稳定转染组）TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多（P< 0. 01）。［结论］成功分离培养脂肪干细胞；以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多，表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化，从而为软骨组织工程提供新的思路和方法。
【关键词】 转化生长因子β1（TGF-β1）； 脂肪干细胞（ADSCs）； 基因转染； RT-PCR； Western-blot
Adipose tissue derived stem cells transferred with TGF-β1 gene and differentiated into chondrocytes∥WANG Hong-lin，MIN Fan-hong ,WANG Yan-feng,et al. Department of Orthopaedics,Jiamusi Central Hospital of Heilongjiang Province,Jiamusi 154002,China
Abstract: ［Objective］To induce TGF-β1 gene which can increase ECM synthesis into adipose tissue derived stem cells（ADSCs） by employing gene transfer techniques and observe whether TGF-β1 gene could expresse continuously and whether type II collagen and aggrecan are synthesized in order to provide experimental data for constructing tissue–engineering cartilage. ［Method］ADSCs were transferred with TGF-β1 gene ,TGF-β1,FN,ColⅡ and aggrecan were detected with RT-PCR and TGF-β1 protein was detected with Western-blot.［Result］RT-PCR demonstrated that the expression of TGF-β1,FN,ColⅡ and aggrecan in the TGF-β1 gene transferred groups increased more evidently than non–gene groups and control groups (P< 0. 01). Western blot demonstrated that TGF-β1 protein in the TGF-β1 gene transferred groups increased more evidently than non –gene groups and control groups significantly (P< 0. 01). ［Conclusion］ADSCs of Wistar rats could be separated and cultured successfully. After TGF-β1 gene was transferred stably into ADSCs, the specific extracellular matrix of chondrocyte differentiation increased evidently. The results demonstrated that TGF-β1 gene could induce ADSCs into chondrocytes.The experiment provides a new methed for constructing tissue–engineering cartilage.
Key words：transforming growth factor-β1（TGF-β1）; adipose tissue derived stem cells(ADSCs); gene transfection; reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR); Western-blot
TGF-β1对ECM的形成有重要作用。TGF-β1能促进体外培养软骨细胞合成II型胶原，有研究表明它可以促进ADSCs的软骨分化［1 ］。但体外培养中添加TGF-β1易流失，且TGF-β1因子价格昂贵，为维持细胞表型和防止细胞退变，需不断添加TGF-β1，因此结合应用转基因技术，将能够促进软骨细胞ECM合成的目的基因导入其中，以此为种子细胞构建一种基因修饰的组织工程软骨(gene modified tissue engineering cartilage)无疑非常具有意义。本研究试图通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞，观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞ECM的两种重要组分:II型胶原(type Ⅱ collage, ColⅡ)和aggrecan的合成，为构建新型的组织工程软骨提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
Wistar大鼠（中国医科大学实验动物部提供）
1.1. 2 主要试剂
pSNAV质粒、pSNAV- TGF-β1真核表达质粒购自北京本元正阳生物公司; DH-5α菌种由中国医科大学微生物教研室提供；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；胎牛血清、高糖DMEM、 G418、Trizol购自GIBCO/BRL公司；DL2000标准分子量、质粒快速提取试剂盒（中量）、RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0试剂盒购自大连宝生物工程公司；TGF-β1兔多克隆抗体和β-actin兔多克隆抗体购自Santa Cruz公司；碱性磷酸酶标记的羊抗兔单克隆抗体购自北京中杉生物技术有限公司。
1.1.3 主要仪器设备
PCR仪（Biometra Unio Ⅱ型，德国）；多功能电泳仪（MultiphorⅡ型,瑞典）；紫外分光光度计（UV-3000型，英国）；凝胶自动成像及分析系统（Chemi Imager 5500，美国）；水浴式转印电泳槽（DYY-Ⅲ40B型 北京六一仪器厂）；台式离心机（Sigmal-13,美国）；匀浆机（Heidolph DIAX600，德国）。
1.2 实验方法
1. 2. 1 质粒DNA的扩增、提取
大肠杆菌菌株的复苏与培养，感受态细菌的制备，质粒DNA的转化，质粒DNA菌株的筛选，质粒DNA中量的提取（即转基因用超纯质粒的制备），按照质粒提取试剂盒的说明进行操作。
1.2. 2 TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选
取成年雄性Wistar大鼠腹股沟处脂肪组织，仔细清除假包膜、血管、结缔组织，在超净工作台中，将组织剪碎，加入0.25%的Ⅰ型胶原酶消化3 h，1 200 r/min离心5 min，含15%FBS的高糖DMEM培养基稀释，纱巾过滤，离心，将细胞收集到1～2瓶50 ml培养瓶中培养。细胞长满80%用0.125%/EDTA胰酶消化传代培养。选取第2代脂肪干细胞，5×105细胞传至35 mm平皿中，37℃,5%CO2培养至细胞密度为90％时进行转染，转染前一天更换2 ml不含抗生素的正常生长培养液；用250 μl DMEM无血清培养基稀释4 μg质粒（pSNAV-TGFβ1，pSNAV）温和摇匀；轻轻混匀Lipofectamine 2000,将10 μl Lipofectamine 2000加入250 μl DMEM无血清培养基中混匀并于室温温育5 min；5 min温育后，混合稀释的质粒DNA和稀释的Lipofectamine 2000，混匀，室温下放置20 min，以使DNA/ Lipofectamine 2000复合物形成；将DNA/ Lipofectamine 2000复合物加入含有细胞和培养基的孔中，摇动培养皿，轻轻混匀；6 h后更换完全生长培养液；转染1 d后，将细胞按1∶10的稀释比例传代至新鲜生长培养液中，第2 d加入G418 400 μg/ml进行筛选；筛选21 d后克隆形成，将其挑至24孔板，生长至融合，转移至6孔板，最后转至50 ml培养瓶中。
1. 2. 3 RT-PCR检测TGF-β1、FN、ColⅡ、Aggrecan
提取总RNA 按照Trizol试剂盒说明书进行；RT-PCR参照Genbank的cDNA序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，委托大连宝生物技术有限公司合成
TGF-β1 5' CTGTGGCTACTGGTGCTGAC 3'
5' CATAGATTTCGTTGTGGGTTTC 3'
FN5' ACCACCCAGAACTACGATGC 3'
5' GATGGGGTCACATTTCCATC 3'
CoⅢ5' GCGAGTCTTGCGTCTACCC 3'
5' ACATCATTGGAGCCCTGGAT 3'
Aggrecan5' CAGTCTACCCAGCACCCTACA 3'
5' CGGGAAAGTGGCGATAACA 3'
进行反转录反应；按下列条件进行反转录反应：30℃,10 min,42℃,30 min,99℃,5 min,5℃,5 min,进行1cycle；按下列条件进行PCR反应：94℃，2 min，1cycle；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，1 min，72℃，7 min，32 cycle；反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
1. 2. 4 Western blot检测TGF-β1
胞浆蛋白的提取采用Folin-酚试剂法进行蛋白定量；Western 印迹杂交，取50 μl蛋白样本，在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，120 V，1.5 h。电泳结束后遵循膜正极胶负极的原则，在水浴式电转印槽中转印至硝酸纤维素膜(NC)上(电压50V电流100 mA，2 h)。转印结束后再TBS液洗膜10 min，以5%的脱脂奶粉封闭过夜。再以TTBS洗2次，每次5 min,分别加入TGF-β1兔多克隆抗体（1∶400，Santa Cruz）和β-actin兔多克隆抗体（1∶400，Santa Cruz），4℃过夜。TTBS洗涤2次，每次5 min后，与碱性磷酸酶标记的羊抗兔单克隆二抗（1∶2000，北京中杉公司）室温孵育2 h，加入碱性磷酸酶底物O-dianidine及β-naphthyl acid phosphate,显色液显色15 min。显色的硝酸纤维素膜(NC)经UPV扫描仪扫描成像，用UPV凝胶分析系统计算曲线下面积得到灰度值。
1. 3 统计学分析
统计采用X2分析，应用SPSS 12.0软件进行统计分析。
2 结果
RT-PCR结果显示:TGF-β1目的基因转染组较未转染组和转染空载体组，其TGF-β1、FN、Col II、Aggrecan的mRNA表达增强(图1、2、3、4，表1)。表1 RT-PCR检测TGF-β1、FN、ColⅡ 、Aggrecan（NI比值）组别TGF-β1FNColⅡAggrecan未转染组0.390±0.0330.655±0.0510.276±0.0160.508±0.063转染空载组0.344±0.0390.639±0.0480.325±0.0120.520±0.041转染组0.920±0.0560.935±0.0631.009±0.0370.895±0.056P值0.0000.0000.0000.000 Western-blot结果显示：转染TGF-β1组较未转染组和转染空载体组，其TGF-β1蛋白表达量明显增高（图5，表2）
在原代培养的ATSCs中，多数为成纤维细胞样细胞的短梭形，少数为多角形（图6）。经传代培养后多角形细胞明显增多，且细胞呈克隆样聚集生长。TGF-β1基因转染后的ADSCs，部分细胞变为圆形或椭圆形（图7）。 表2 Western-blot检测TGF-β1组别
3 讨论
在脂肪组织里发现并提取多向分化干细胞则最早于2001年由Zuk PA和 Zhu Min［2］从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得。由于脂肪组织来源干细胞(ADSCs)取材容易，并且可以把抽脂术中过去都扔掉的脂肪组织悬液变废为宝，成为人干细胞库的重要来源，可在局麻下通过腹部的吸脂术获得，对患者损伤较小，且获取相对容易，对肥胖者尤其适合。因此虽然发现较晚，但研究非常迅速深入。目前已经证实ADSCs能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导转化,可作为多种组织工程的种子细胞，有非常重要的研究和应用价值。国内余方圆［3］从兔脂肪组织中分离出干细胞，并将脂肪干细胞向软骨方向转化。Mochizuki等［4］利用脂肪干细胞在体内外成功构建了组织工程软骨,使之成为了软骨组织工程领域又一理想的种子细胞。
基因转染常用的载体有:病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒(adeno associated virus, AAV)，该类载体具有易于转染各种体细胞、可获得高滴度病毒等优点，是目前基因转染技术中应用最为广泛的载体，但具有潜在致癌、产生针对病毒蛋白而发生的免疫反应和因剂量过大而产生毒性的危险。本研究选用脂质体为载体，因其与细胞膜结构十分相似，也极易附着于细胞膜。以脂质体为载体的目的基因随脂质体进入胞浆而被导入细胞核内，该类载体无毒性和致癌等危险，经在RNA和蛋白质水平检测，均证实转染成功。基因工程技术应用于组织工程领域有其独特的优势:转化细胞可持续高效表达目的基因以调控其自身及其它效应细胞的生长;转染细胞合成分泌的内源性蛋白具有更多可识别的配体，能更有效地同细胞表面受体结合使其表达产物活性更高，所需产物量更小(ng或pg水平)，减少了外源性重组蛋白(mg或μg)反复使用的副作用等。价格远低于纯化的重组蛋白。因此，结合应用转基因技术，将能够促进软骨细胞ECM合成的TGF-β1基因导入其中，以此为种子细胞构建一种基因修饰的组织工程软骨无疑非常具有意义。
TGF-β1 是一族具有多种功能的多肽类生长因子，可以调节多种细胞的生长和分化。在胚胎软骨形成过程时，TGF-β1 可以诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨组织，并具有促进软骨细胞增殖和成熟，增加软骨细胞合成和分泌蛋白多糖的作用［5］。Worster对间充质干细胞( marrow mesenchymal stem cells, MSCs)体外培养时发现，在培养基中加入TGF-β1可以诱导MSC定向分化为软骨细胞，其II型胶原的表达与TGF -β1的剂量呈正相关，5～10 ng/ml的TGF-β1可有效地促进MSCs向软骨方向的分化［6］。TGF- β1 浓度达到10ng/ml 可使Ⅱ型胶原、Aggercan 等因子的表达量提高2 倍以上, 促使ATSCs 向软骨方向分化［1］。主要通过两种途径促进软骨细胞生成：（1）促进干细胞分化为软骨，TGF-β1 能诱导MSCs 转化为软骨细胞,并促进其增殖,同时还能抑制成熟软骨细胞的增殖和分化。Liechty 等［7］ 研究发现,在大鼠胚胎中的间充质干细胞和骨膜来源细胞中,TGF-β受体可大量表达,能促进软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原,维持软骨细胞表型稳定。（2）促进软骨特异性基质的合成。Pittenger 等［8］ 研究表明, TGF-β 能增加GAG 的合成, 同时也可改变GAG 的糖基模式,使硫酸软骨素链加长,磷酸化程度更高,从而使GAG 更加致密和富有弹性,符合软骨的生理特性。TGF-β不仅能刺激胶原合成,而且作为一种强力趋化因子,可增加细胞外骨基质,对于调节骨与软骨形成有重要作用［9］ 。因此，TGF-β1是诱导干细胞向软骨分化的首选因子。
TGF-β家族由40多个多肽构成，具有高度同源性，尤其梭基端7个保守片段。TGF-β超家族的细胞因子对成软骨诱导分化的作用主要通过两种细胞内信号路径来转导。第1种路径主要涉及信号分子SMAD家族［10］，第2种路径主要涉及活化蛋白激酶信号路径［11］。这两种信号的级联放大作用都是通过相同的TGF-β受体复合体激活的。这种复合体由两种不同的跨膜蛋白组份(Ⅰ型和Ⅱ型受体)，通过异二聚体化和TGF-β超家族的细胞因子结合。研究表明成软骨分化时通过TGF-β激活的信号级联放大和Wnt路径在调控上存在交联关系［12］。 TGF-β超家族生物活化的调控是通过和细胞外基质蛋白如β-聚糖等相结合产生的相互作用来实现的［13］。通过改变细胞因子和相应细胞表面受体的结合来调控TGF-β超家族生物活化。
脂肪干细胞的定向分化有二条调节途径，为内源性调控和外源性调控。应用外源性添加TGF-β1诱导ADSCs成软骨分化的研究中发现，该因子可以促进细胞外基质的合成，诱导ADSCs成软骨分化［14］，本研究中，TGF-β1目的基因转染ADSCs后，能够促使纤连蛋白(FN)的合成增强,促进其成软骨分化的特异性细胞外基质ColⅡ, Aggrecan表达量显著增强；从内源性调控途径证实TGF-β1基因修饰可以诱导ADSCs成软骨分化，从而为构建组织工程软骨提供新的思路和方法。
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作者单位：（1.黑龙江省佳木斯市中心医院骨外科 154002；2.中国医科大学附属第一医院骨科，辽宁省沈阳市 110001）