BMP/bFGF生物活性材料修复关节软骨损伤的实验研究

【摘要】  ［目的］探讨骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)生物材料在关节软骨缺损修复过程中的作用,为内源性修复关节软骨缺损提供实验基础。［方法］取24只14龄成年大白兔随机分成4组，每只动物于双侧膝关节股骨膑股关节面制备直径5mm全层关节软骨缺损模型。钻通骨髓腔。A组应用BMP/ bFGF生物活性材料，B组应用BMP生物活性材料，C组应用bFGF生物活性材料，D组单纯应用生物蛋白胶材料。于8、12、24周在大体，光镜及电镜下观察损伤修复效果，组织学评分。 ［结果］A组于8、12周时，软骨缺损被白色半透明坚硬组织平滑修复，富有光泽，24周时修复组织正常软骨边界模糊，连接紧密，质地坚硬，表面平滑光润。B、C组于8、12、24周时候均未见软骨缺损完全修复，边界清楚，中央凹陷明显残留。D组全程均未见软骨修复。组织学平分A组明显优于B、C、D组，而B、C组之间无差别。［结论］BMP/bFGF生物活性材料可以有效修复兔大面积关节软骨损伤，疗效明显优于单独应用骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子，为关节软骨损伤治疗提供新的治疗方法。

【关键词】  骨形态发生蛋白； 碱性成纤维细胞生长因子； 软骨缺损； 生物蛋白胶

    Experimental study on repair of cartilage defects with combined BMP/bFGF biomaterial∥LIN Jiasheng, ZHAO Chengbin, LI Huazhe. Department of Orthopaedics, the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

    Abstract：［Objective］To study the repair of articular cartilage defects with combined bone morphogenetic protein(BMP)/basic fibroblast growth factor (bFGF) biomaterial in order to supply experimental basis for repairing cartilage defects biologically.［Method］Twentyfour 14weekold  rabbits were randomly divided into four groups,BMP/bFGF biomaterial gel(group A), BMP biomaterial gel (group B), bFGF biomaterial gel(group C) and simple fibrin glue treated group (group D).A couple of  knees of each rabbit experienced 5 mmdiameterfull cartilage resection and drilling throuth of bone marrow.Gross appearance,histologicol section and  electron microscope were axamined at 8,12,24 weeks after operation.［Result］In  group A the cartilage defects were smoothly repaired by white translucent hard tissue at 8 and 12 weeks,and defect boundary was hard to be indentified with normal cartilage at 24 weks. No smooth repairing was observered in B,C and D groups.  Group A got a better histological score than B,C and group D(P<0.05). No difference exited between B and C groups (P>0.05).［Conclusion］Combined BMP/bFGF biomaterial is good for repair of articular cartilage defects and has better result than using BMP or bFGF alone.These results may provide a therapy for articular cartilage defects.

    Key words：bone morphogenetic protein;   fibroblast growth factor;  basic defects of cartilage;  fibrin glue

    关节软骨缺损是临床常见疾病，病人会出现关节疼痛及运动障碍，最终引起骨性关节炎。 关节软骨缺损的修复是骨科研究的热点。目前常用的是外源性修复方法，如钻孔术、骨膜和软骨膜移植、细胞移植、骨软骨移植等，尽管软骨细胞移植在理论上更为有利，但依照国内外实际情况，自体软骨细胞回植的治疗方法在取材，培养，防止污染和经费方面都有困难，而且疗效也并不完美［1］。随着分子生物学研究的进展，发现软骨缺损的修复过程是一个多种因子参与的复杂过程。所以本研究基于临床实际情况，利用有效生物活性材料，为内源性软骨修复提供实验参考。

    1   实验方法

    1.1  实验材料

    　　14周龄哈尔滨大白兔24只，哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供；医用生物蛋白胶， 广州倍绣生物技术有限公司；重组人碱性成纤维细胞生长因子，美国invitrogen生物有限公司； 牛天然骨形态发生蛋白，天津中津生物发展有限公司；戊巴比妥钠， 上海化学试剂厂。

    1.2   BMP和bFGF生物蛋白胶复合材料的制备［2］

    　　溶解60 mg/ml纤维蛋白原(50 000 u/ml和500 mg/ml)1 ml，准备凝血酶原溶液(500 u/ml)1 ml。改进共推注射器，控制其微量出液。纤维蛋白原和凝血酶原组通过“Y”形针头混合后立即成为固体状态。

    　　30 mg骨形态发生蛋白溶于2 mL 4 mol/L盐酸胍、10.05 mol/L氯化钙溶液中,兑水透析24 h，备用。如果需要保存，将稀释液在-20°C条件下贮存。

    　　先用0.1%胎牛血清蛋白1 ml溶解0.1 mg碱性成纤维细胞生长因子（防止碱性成纤维细胞生长因子粘附于安瓶内），将稀释液溶解于1 ml Tris液备用。如果需要保存，将稀释液在-20°C条件下贮存。

    1.3   模型制备

    1.3.1  动物分组       A组6只，利用BMP/bFGF生物活性材料治疗（n=12）；B组6只，BMP生物活性材料治疗；C组6只，bFGF生物活性材料治疗（n=12）；D组6只,生物活性材料治疗（n=12）。

    1.3.2  动物建摸       全麻（2%戊巴比妥钠1.2 mL/kg耳缘静脉麻醉）,双膝关节常规备皮、消毒，铺巾。取膝关节内侧小切口，向上向下少许锐性分离，屈曲膝关节将髌骨脱位于外侧，暴露股骨滑车关节面，制造直径5 mm、深3  mm的圆形全层软骨缺损。同时钻通骨髓腔。充分止血，利用共推针头注入各组活性材料，填满缺损。细致休整表面。冲洗，逐层缝合。对侧操作同上。术后置于标准动物实验笼中，每日活动，加强锻炼。术后8 、12 、24周每组空气处死2只动物，观察大体、光镜、电镜指标。

    1.4  观察指标

    1.4.1   一般观察      术后步态，膝关节活动范围，切口情况，动物大体状态和进食情况。

    1.4.2   关节修复的大体观察      表面平整与否，色泽，质地，与临近软骨结合情况。

    1.4.3  光镜观察  　  10℅甲醛固定，0.1 mol/L EDTA脱钙，梯度逐级脱水，缺损区纵形剖开石蜡包埋，4 μm超薄切片。HE、PAS染色，观察组织形态和蛋白多糖沉积情况。

    1.4.4  扫描电镜观察  　　标本取材后纵行剖开，磷酸盐缓冲液漂洗，戊二醛溶液固定，置入锇酸2 h,洗净，逐级脱水，临界点干燥，喷金后电镜观察。

    1.4.5  组织学评分  　  根据Wakitani等制定的评分标准，采用双盲法对各标本进行组织学评价。

    2   结  果

    2.1  BMP/bFGF生物蛋白胶的制备

    在20℃左右的室温条件下，bFGF及 BMP溶液可以很好的溶解于纤维蛋白原中成为透明液体，与凝血酶混合后，于5 s内迅速凝结，成为固态胶体。材料白色半透明，富于光泽，质地松软而脆弱，充填于软骨缺损部可以很好的适应软骨的曲线，并可将修饰得非常平滑。注射过程应该均匀而快速，注于缺损部后待凝胶成型后，注意休整表面与正常关节面一致。

    2.2   大体形态和一般状况

    　  所有动物均无膝关节感染和积液发生。A组１只，B组２只，C组２只动物跛行（4周左右），关节活动受限。余所有动物均未见跛行，其膝关节活动范围较术前无明显改变，表现活跃，食欲佳。大体观察，A组：软骨缺损区均为修复组织所充填，表面光滑，半透明状而有光泽。术后8周修复组织成白色，质地坚韧，与周围组织结合紧密，但可清楚的显示界限，表面平滑与关节面曲线配合完善；术后12周修复组织仍成白色坚韧组织，与周围组织融为一体，边界趋与模糊，表面更趋平整；术后24周修复组织成为白色半透明软骨样组织，与周围软骨结合为一体，表面稍微凹陷，关节表面平滑，坚硬。B组，C组：术后8、12、24周均未出现完整平滑关节面修复现象，表面凹凸不平，只是在缺损边缘有部分修复组织出现，中央缺损长期存在，被暗红色疏松结缔组织充填，修复组织与正常软骨界限清楚。D组也完全没有出现修复现象出现 。

    2.3  组织学观察

    A组：术后8周，HE染色见缺损已经被明显修复，大量软骨细胞出现，圆形和椭形胞核清晰，有软骨陷凹出现，修复组织与关节缺损边缘软骨结合紧密，PAS染色见基质出现蓝染，糖胺多糖类物质开始大量沉积；术后12周，修复组织厚于正常软骨，修复组织与其结合紧密，以类透明软骨细胞为主，大量增殖，软骨陷窝大量出现，表层软骨细胞稀疏体积小，而底层细胞量多且较为巨大，呈现分层分布的特点，基质PAS染色见明显蓝染，糖胺多糖类物质沉积更为明显；术后24周，软骨厚度稍变薄，软骨陷窝明显，修复组织与正常软骨界限模糊，结合紧密，蛋白多糖类物质明显沉积，部分区域出现纤维软骨特点。B组、C组：术后缺损未被有效修复，中央凹陷表面长期残留，缺损内部被大量肉芽组织填充，边壁出现骨板，基质染色见少数靠近骨板的局部出现软骨基质沉积。D组：8、12、24周术后软骨缺损长期存在，缺损处被大量肉芽组织所填充。质地松软，与周围无明显连接，HE染色未见软骨细胞出现，PAS染色未见糖胺多糖类物质沉积。

    2.4   电镜下观察

    　　A组术后8、12周电镜下表层可见纵行排列的软骨细胞、软骨囊,软骨细胞之间可见间隙及成熟的软骨基质，部分软骨钙化；术后24周组:电镜下软骨基质胶原排列规则，软骨厚度均匀，软骨下方为排列规则的骨髓腔（图1～11）。

    2.5   组织学评分

    双盲法测定，结果显示，A组（1.92±0.69）明显优于B组（3.58±0.67），C组(3.33±0.89)及D组(12.45±1.05)。SPSS13.0软件进行方差分析，A组和B 、C 、D 3组均存在显著性差异(P<0.05) ；B、C、D组存在显著性差异(P<0.05)；而B组和C组没有统计学差异(P>0.05)。

    图1  BMP/bFGF生物活性材料组术后8周大体观察  图2  BMP/bFGF生物活性材料组术后12周大体观察  图3  BMP/bFGF生物活性材料组术后24周大体观察  图4  BMP/bFGF生活活性材料组术后8周（HE染色×40）  图5  BMP/bFGF生活活性材料组术后12周（HE染色×40）  图6  BMP/bFGF生活活性材料组术后24周（HE染色×40）  图7  BMP/bFGF生活活性材料组术后8周（PAS×40）  图8  BMP/bFGF生活活性材料组术后12周（PAS×40）  图9  BMP/bFGF生活活性材料组术后24周（PAS×40）  图10  BMP/bFGF生活活性材料组术后24周电镜水平扫描×1000  图11  BMP/bFGF生活活性材料组术后24周电镜纵向扫描×1000

    3   讨  论

    　　创伤、骨关节病等多种疾病均可造成关节软骨缺损。由于关节软骨不能自身修复，如何修复关节软骨缺损是骨科的研究热点之一。许多学者应用软骨生长板移植、软骨膜移植、骨膜移植及软骨细胞移植等多种外源性修复方法进行实验及临床研究。肌腱和筋膜瓣插入关节成形术主要应用于上肢关节，特别对于改善拇指功能有较好效果。1992年赵距才等报道动物实验术后3个月，移植的筋膜退变，成形的关节严重退变。Knight认为成形术只能提供一个无痛或微痛的有一定活动度的关节，不适于需要一个稳定、牢固、灵活关节的病人。自体骨软骨移植治疗关节软骨缺损的远、近期效果较好，但自体移植取材有限；同种异体移植远期有退变、易感染、易被吸收等问题。骨膜和软骨膜移植也是一种较好的修复关节软骨缺损的方法。骨膜生发层中的未分化间充质细胞可分化为骨细胞或软骨细胞，在关节腔内无血液供应低氧环境中分化为软骨细胞。但再生软骨有退变可能，持续被动运动(CPM)有利于骨膜再生软骨，并降低退变率。软骨膜再生软骨能力强，但来源少，再生软骨较正常软骨耐压能力差，并随时间延长逐退变。组织工程方法培养软骨细胞移植适合修复各种形状的软骨缺损，具有一定优势，但其缺点是自体有活性的软骨收集困难，同种异体细胞又有传播病毒的危险。

    　　随着细胞因子研究的深入，发现多种细胞因子通过自分泌和旁分泌2种方式调节骨和软骨的生成, 其中主要有骨形态发生蛋白(BMP)、bFGF、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素生长因子(IGF)、血小板衍生因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)等。这些因子的发现使内源性修复关节软骨缺损成为可能。

    　　BMP具有诱导未分化间充质细胞分化形成软骨和新生骨的生物学作用，在体外能诱导骨髓腔内骨髓源性干细胞，关节腔内的脂肪组织、髌韧带组织和滑膜组织的细胞分化为软骨细胞［3］。BMP能诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化形成软骨和骨，但BMP仅是骨生成的启动因子，对已分化的成骨细胞、骨细胞及软骨细胞无进一步促进其增殖作用。而软骨细胞形成后的进一步生长、增殖、分化是由其它骨生长因子调节的。bFGF广泛存在于人体组织中,对骨和软骨的修复起重要的作用，特别它是一种毛细血管增殖刺激剂，促进毛细血管向骨移植物中长入，使软骨生成早期的组织中软骨岛数量增多。所以它增加BMP成骨量的原理可能促进了需要血供的软骨内化骨，加速了软骨的成熟和骨化。因而BMP启动骨形成过程后，为bFGF提供了大量靶细胞。另一方面，bFGF无异位诱导成骨活性，BMP的异位骨诱导作用又可弥补bFGF的不足，从而使BMP和bFGF在生物学功能上形成互补，进而加速骨诱导、软骨形成过程。尽管BMP和bFGF的作用有着显著的差别，但它们在骨诱导、软骨形成中的调节是必不可少的。二者在不同水平和不同环节上参与对骨诱导、软骨形成过程的调节。在适宜的剂量下，二者存在着明显的协同作用［4］。医用生物蛋白胶具有良好生物相容性，可以完全被降解。由于其特有的三维网架结构营养物质的扩散，所以是关节内软骨修复的良好载体。有人用生物蛋白胶作为IGF-1的控制载体，用于治疗马的关节软骨损伤，取得良好的效果［5］。

    　　本实验发展了这种天然材料，采用BMP/bFGF生物蛋白胶联合应用修复关节软骨缺损。结果表明，其关节软骨缺损修复效果明显优于单独应用其中一种因子，可见12例膝关节软骨缺损均愈合良好，关节面光滑、完整、无裂隙、富有弹性，与周围软骨界限不清，缺损区内软骨细胞丰富，排列趋于正常，软骨下骨进一步改建，软骨厚度基本达到正常。基质PAS染色见明显蓝染，糖胺多糖类物质沉积更为明显。而单独采用BMP/生物蛋白胶或bFGF/生物蛋白胶修复关节软骨缺损，由于功能较单一，可能在体内被降解后才可以被利用，较低的生物利用度限制了BMP及bFGF应用疗效的发挥。所以，软骨缺损均未愈合良好，关节面凹凸不平、表面不完整、裂隙清楚、基质PAS染色蓝染较淡，糖胺多糖类物质沉积不明显［6］。

    综上所述，认为:（1)BMP及bFGF具有诱导形成软骨的活性,能促进关节内透明软骨再生，但能力较弱，无诱导关节软骨形成作用；（2)BMP/bFGF生物复合物能促进关节软骨形成,较单独应用BMP、bFGF效果好,是生物学修复关节软骨缺损的良好方法。

【参考文献】
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［3］ 胡益华，林月秋 ，阮 默. rhBMP-2临床应用研究新进展［J］.西南国防医药,2007,5: 663-665.

［4］ 李 毅，陈槐卿 ，成 敏，等. 骨髓基质干细胞BMP-2和bFGF基因的联合修饰［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2006,2:133-136.

［5］ 李文辉,等.可注射性藻酸钙凝胶修复整合兔膝关节骨软骨缺损实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2005，13：372-375.

［6］ 陈 福，陈 鹤，靳占峰，等. rhBMP和bFGF对大鼠胫骨平台骨折后关节软骨的修复作用［J］. 骨与关节损伤杂志,2003,6:388-400.

作者单位：（哈尔滨医科大学附属第四医院骨科，哈尔滨 150001）