EPO硬膜外途径干预大鼠脊髓损伤后caspase3及FasL表达与细胞凋亡的相关性研究

【摘要】  ［目的］在大鼠急性脊髓损伤后不同时间硬膜外腔注射促红细胞生成素, 观察并探讨其对脊髓神经功能的保护作用以及对脊髓神经细胞凋亡的影响。［方法］将48只体重（270±10) g成年雄性SpragueDawley大鼠随机分为正常组（n=6），假手术组（仅切除椎板，n=6），对照组（1、6、24 h组分别给与等量生理盐水硬膜外注射,n=18），实验组（1、6、24 h组分别给与5 000 u/kgbw的rhEPO硬膜外注射，n=18）。按改良Allen打击法建立大鼠脊髓不完全损伤模型, 通过动物神经运动功能BBB评分及斜板试验评价神经损伤程度; 分别采用TUNEL法及免疫组化法检测脊髓神经细胞凋亡指数和Caspase3，fasfasl死亡蛋白的表达。光镜下观察统计分析结果。［结果］与对照组相比,脊髓损伤后促红细胞生成素1、6、24 h干预的实验组神经运动功能均有改善，脊髓神经细胞凋亡指数均明显下降(P<0.01)；实验组中，fasfasl死亡蛋白较对照组表达减少。2组中神经细胞凋亡数与Caspase3、fasfasl死亡蛋白表达细胞数呈线性正相关（P<0.01），相关系数分别为r = 0.941 (Caspase3)和r=0.929（fasfasl）。［结论］早期应用外源性EPO对脊髓不完全损伤具有保护作用，可明显改善神经运动功能恢复情况,此种保护作用可能与EPO能够阻断Caspase3、fasfasl死亡蛋白途径的神经细胞凋亡有关。

【关键词】  脊髓损伤； 促红细胞生成素； 凋亡； Caspase3； FasL； 硬膜外腔注射

　Protective effects of erythropoietin by epidural injection  on neurocyte apoptosis and relative proteins after spinal cord injury in rats∥CHEN Shuqiang, XU Youjia, YU Chen,et al.Department of Orthopedics,Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004,China

    Abstract：［Objective］To investigate the protective effects of rhEPO on neuromotor function and apoptosis of neural cell,after it was peritoneally injected at different time in rats with traumatic spinal cord injury(SCI). ［Method］A total of 48 adult male SpragueDawley rats weighting 270 ±10 g were  randomly divided into four groups. Rats in normal group（n=6）and sham group (n=6) underwent laminectomy producure only.In  control group, rats (n=18) received normal saline epidurally at 1,6 and 24 hours  after injury. Treatment group  (n=18) received 5000 iu/kg body weight of recombinant humane erythropoietin administered epidurally  at 1,6 and 24 hours after injury. SCI was induced with 70g/cm impact according to the improved Allen method . Behavioral evaluation of the rats was made 48 hours after trauma  using the Basso,Beattie, and Bresnahan (BBB) scoring system and Rivlin’s tiltboard experiment.Injured spinal cord tissue cell apoptosis was examined by the terminal deoxynucleotidal transferasemediated dUTPbiotin nick end abeling (TUNEL) reaction at 48 hour.Fasl and Caspase3 expression was determined by immunohistochemical analysis at 48 hours after injury. The results were observed by light microscope and analyzed by SPSS statistics software.［Result］Compared to the  control group, neuromotor function was significantly improved at 1,6,and 24 hours after injury in the experiment group. The indexes of neural cell decreased significantly (P< 0.01). Fasl and Caspase3 expressed less in the experiment group.The number of neural cells was posibively correlated with the number of Caspase3(r=0.941)and Fasl ( r = 0. 929) expressed cells(P<0.01).［Conclusion］Analysis of the results indicated that apoptosis plays an important role in the secondary spinal cord injury.Activation of Fasl and Caspase3 may be related to cells apoptosis in the injured spinal cord． Early application of rhEPO could improve the  neuromotor function. The protection is partially due to the reduction of neural cell apoptosis.

    Key words：spinal cord injury;   erythropoietin;  apoptosis;   Caspase3;   FasL;   epidural injection

    脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是骨科常见的严重疾患,一般预后较差，致残率很高。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)近年来发现其不仅影响红系细胞，而且是一种多功能的营养因子，特別是对中枢神经有良好的保护作用，并有望成为治疗SCI的一种新型药物［1～3］。国内外已有研究中认为EPO有抑制SCI后神经细胞的继发性损伤，抑制神经细胞凋亡，保护受损神经元［4～6］的作用。本实验在脊髓损伤后不同时间给与rhEPO硬膜外腔注射，通过测定EPO对凋亡过程中的凋亡相关蛋白表达的影响，探索其抑制神经细胞凋亡的可能机制。

    1   材料与方法

    1.1    成年雄性SpragueDawley（SD）

    大鼠48只 (苏州大学医学院实验动物中心提供) ，清洁级,体重260～285 g，平均270.6 g。按实验设计将大鼠随机分4个大组。正常组，仅给与麻醉 (n= 6)； 假手术组，麻醉后行椎板切除术(n= 6)； 对照组，建立脊髓损伤模型，硬膜外腔注射生理盐水，分术后1 h组(n= 6)，术后6 h组(n= 6)，术后24 h组(n= 6) ；实验组，建立脊髓损伤模型，硬膜外腔注射rhEPO（日本麒麟啤酒株式会社），5 000 u／kgbw：分术后1 h组( n= 6)，术后6 h组(n= 6)，术后24 h组(n= 6)。

    1.2  脊髓损伤模型的制作

    采用改良Allen打击法［7］制作大鼠脊髓损伤模型。手术严格在无菌条件下完成。大鼠用40 g/ L 水合氯醛(10 ml/ kg) 腹腔注射麻醉。备皮后，俯卧位固定，消毒，铺盖无菌巾单。按照Nystrom法［8］，以T12为中心, 切开皮肤和肌肉, 长约2 cm , 显露T11～13棘突和椎板, 咬除T12棘突和椎板,以T12脊髓为中心显露大小为4 mm×6 mm的打击区。在硬膜表面垫一曲度与脊髓表面一致的塑料垫片，用直径2.5 mm、重10 g的圆柱状金属棒在细玻璃管的引导下从7 cm高处垂直落下打击，造成以T12为中心的脊髓急性挫伤(致伤力为70 g·cm)。损伤后每天3次人工按压膀胱排尿。假手术组仅行椎板切除。实验各组大鼠均肌注青霉素QD，分笼饲养。

    1.3  硬膜外埋管术

    打击后行硬膜外埋管,将长约6 cm、内径0.3 mm、外径0.6 mm 的PE10聚乙烯管（宁波安来科技有限公司）直视下由伤口向大鼠尾端插入硬膜外腔约0.5 cm，严密缝合伤口、肌肉层及筋膜层以防渗漏并固定导管，然后从皮肤切口一侧用注射器针头引出，缝合伤口后用酒精灯烧灼末端封闭导管。

    1.4  rhEPO干预方法

    分别于大鼠脊髓损伤后1、6、24 h，剪除导管末端，用1 ml无菌胰岛素注射器（针尖29 G），连接导管注药，缓慢推注约30 s。注药完毕后夹住导管，重新封闭。 实验组予以rhEPO，5 000 u/kgbw。对照组予以相同体积生理盐水。

    1.5  取材

    本研究在伤后48 h对大鼠行多聚甲醛（浓度为4%）心内灌注固定，取损伤中心约5 mm脊髓组织，在10%甲醛中固定24 h后做成蜡块。每个标本取损伤中心及头尾两端各3张做成石蜡切片。

    1.6  免疫组织化学染色

    切片在0. 01 mol/ L PBS 中漂洗5 min ×3 次;正常羊血清室温下孵育20 min ,不洗;置入兔抗鼠Caspase3 p20 亚单位一抗 (武汉博士德公司) 孔板内,室温下孵育16 h ;取出切片,PBS 清洗5 min ×3 次,置入二抗(1∶200 ,生物素化羊抗兔抗体) 中室温下孵育2 h ; PBS 清洗5 min×3 次,置入ABC 溶液室温下孵育2 h ; 挑出切片在PBS 中漂洗5 min×4 次, 用DAB/H2O2显色,至效果最佳,PBS 终止反应,置入PBS 中漂洗5 min×3 次;切片在室温下裱片、风干；1%甲基绿复染,自然晾干,酒精迅速脱水,二甲苯清片,中性树胶封片。同样方法做fasl染色。

    1.7  原位末端标记法检测凋亡神经细胞(TUNEL标记)

    采用原位细胞死亡检测试剂盒(武汉博士德公司) ,具体方法参照说明。主要步骤: 石蜡切片脱蜡和水化后,双蒸水冲洗,0.05 mol/L PLPBS(pH 7. 6) 冲洗;20 mgPL 蛋白酶K溶于10 mol/L PL Tris HCl 液中(pH7. 4) ,37 ℃水浴槽内消化30 min,PBS 洗5 min×3 次;滴加TUNEL 反应液(TdT 酶溶液和地高辛标记的核苷酸混合物溶液于使用前按1∶1 比例混合) 。每张切片50 μm ,37℃孵育60 min。PBS 冲洗后碱性磷酸酶转换液(AP  anti DIGFragment) 37 ℃孵育30 min。PBS 冲洗后,NBTPBCIP 显色5～15 min ;PBS 冲洗后,核固红复染、脱水、中性树胶封片。

    1.8  细胞计数

    采用OlympusBX60显微镜双盲法进行镜检，观察大鼠急性脊髓损伤后凋亡神经细胞及其相关蛋白的表达情况。每个标本取损伤中心及头尾两端3张切片，由2名非本课题组并且熟悉脊髓神经凋亡细胞形态的实验人员200倍光镜下随机选择6个不重叠视野观察统计凋亡细胞数。

    1.9  统计学分析

    实验数据采用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析和t检验，以P<0.05差异有显著意义。Caspase3、Fasl的表达和TUNEL标记凋亡细胞计数结果采用直线相关分析。

    2   结   果

    2.1   细胞形态学观察

    2.1.1  TUNEL标记凋亡细胞       TUNEL 标记的阳性细胞胞核呈棕黑色,正常组及假手数组仅见偶染细胞,生理盐水对照组可见大量阳性细胞表达，白质及灰质中均可见，以白质中为主：阳性神经元细胞核呈深褐色，胞浆呈棕色；阳性角质细胞较小，呈深褐色点状（图1）。

    2.1.2  Caspase3的免疫组化表达  　　　Caspase3 表达的阳性细胞胞浆呈棕黄色。阳性细胞在假手术组、伤后1 h偶尔表达，Caspase3的阳性细胞表达最多见于小胶质细胞、少突胶质细胞和运动神经元；损伤后6 h开始出现,主要位于脊髓灰质背角的小神经元,而腹角的运动神经元和白质表达的细胞较少；伤后24 h在灰质和白质表达的阳性细胞逐渐增多(图2) 。

    2.1.3  FasL的免疫组化表达  　　　FasL表达阳性的细胞其胞浆呈棕黄色。在正常组、假手术组中几乎无表达。对照组中有大量表达多见于胶质细胞、神经元细胞中，以少突胶质细胞最多见。白质和灰质中均可见（图3）。

    图1a～c  TUNEL标记的阳性细胞核呈棕黑色（→所示）400倍

    图1a  正常组  图1b

    NS组  图1c  EPO组

    图2  Caspase3表达的阳性细胞胞浆呈棕黄色，多见于小胶质细胞、少突胶质细胞和运动神经元  图2a  EPO组图2b  NS组  图3  FasL表达阳性的细胞戎胞浆呈棕黄色（→所示）400倍  图3a  EPO组  图3b  NS组

    2.4  细胞计数及数据分析

    　　　NS1 h、NS6 h、NS24 h各组中凋亡细胞数量差异不是很大。与生理盐水对照组比较，rhEPO1 h组、6 h组与24 h组神经元和少突胶质细胞的TUNEL阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。（表1）EPO干预组Caspase3、FasL阳性细胞数与生理盐水对照组比较, 有明显下降(P<0.05)。2组的凋亡阳性数与Caspase3、FasL阳性细胞数成正相关，相关系数分别为r=9.41和 r=9.29（P<0.01）。 表1  损伤脊髓断面Tunel凋亡、Caspase3、FasL阳性细胞个数

    3  讨  论

    3.1  脊髓损伤的细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达

    脊髓损伤包括直接损伤和继发性损伤两个阶段。以往认为脊髓损伤继发性细胞死亡是由坏死引起,近年来人们发现,除坏死外,还存在细胞凋亡［9,10］,并发现其对脊髓损伤的预后有重要意义。抑制或防止凋亡发生，成为有效治疗脊髓损伤的重要途径。

    细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，所涉及的因素及信号传导途径非常复杂。目前认为可能的途径有：(1)通过死亡因子(TNF／TNFR，FasL／Fas)激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)级联反应系统，导致凋亡；(2)通过线粒体释放的细胞色素c(CytC)与细胞凋亡蛋白酶活化因子(Apaf1)及dATP的结合产物激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)级联反应系统，导致凋亡；(3)通过一氧化氮(NO)、Ca2+ 以及非Caspase3途径的凋亡。

    　　半胱氨酸蛋白酶(Caspase) ,也称ICE 样蛋白酶,被认为是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶,它是直接水解激活与DNA 断裂等凋亡特征性改变密切相关的蛋白,所以又称为死亡蛋白酶［11］ 。已发现有14 个家族成员,分2大类: 一类参与激活Caspase 家族的其他成员,包括Caspase1、2、4、5、8、9 和10 ; 另一类则介导细胞凋亡下游的执行阶段,包括Caspase3、6、7、14 。其中Caspase3 是凋亡过程中最重要的蛋白酶,是多种凋亡途径的共同下游效应部分,是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。许多研究认为,在缺血和外伤性脊髓损伤动物模型中,可见到Caspase3活性的增强［12］。 雪亮等的研究表明Caspase3通过其结构改变或影响特定信号分子而参与细胞凋亡的发生［13］ 。Emery 等［14］报道在15 例外伤性脊髓损伤后3 h～2 个月死亡病人的脊髓中,发现胶质细胞凋亡与Caspase3 激活有关。这说明通过干预Caspase3激活凋亡的途径，或许可以阻止或减少细胞凋亡的发生。

    　　Fas是凋亡诱导受体，它是一个跨膜信号转导蛋白，N段在细胞外，死亡序列在细胞外。Fas包含肿瘤坏死基因家族序列，也被包含在肿瘤坏死基因超家族中，是通过与交联抗体和Fas配体结合，通过死亡区域激活所在细胞的细胞内信号级联放大效应导致细胞凋亡［15］，因此Fas被叫做死亡受体。Fas配体是另一个跨膜蛋白，也属于肿瘤坏死基因家族，FasFasL的相互作用被认为在凋亡中起关键作用。Fas与其配体FasL结合可激活Caspase3，启动凋亡信号，最终导致细胞凋亡。

    3.2  促红细胞生成素的抗凋亡作用

    　　促红细胞生成素是一种调节红细胞生成的肾源性细胞因子，已被认为对中枢神经有明显的神经细胞保护作用［1～3］。这些作用主要是：包括调节微循环的作用，抑制凋亡减轻炎症反应及抗氧化作用，调节细胞兴奋性和神经干细胞分化增殖作用等。虽然在脊髓损伤中EPO的具体神经保护作用的机制还不清楚，但研究表明EPO在继发性损伤中对凋亡有着显著的影响力。最近的研究证实，EPO在体内和体外的多种神经细胞损伤模型中都有抗凋亡作用。

    　　脊髓缺血性损伤后，经生理盐水处理的实验动物脊髓前角运动神经元TUNEL标记是广泛而明显的，而经EPO治疗的实验动物脊髓前角运动神经元几乎没有TUNEL标记．说明EPO能够抑制脊髓损伤后神经细胞的凋亡［16］。在大鼠脑梗塞模型的脑组织切片的TUNEL 染色发现, 实验组(栓塞同时静注EPO) 局部缺血内的阳性标记凋亡神经元明显少于对照组,甚至消失。一些体外实验的结果也同样印证了EPO的抗凋亡作用［17,18］。 在运动神经元培养中，EPO能抑制因血清缺乏或红藻氨酸诱导的细胞凋亡。EPO是通过何种途径来起作用的呢，其抗凋亡的机制是否是阻断了细胞凋亡的触发通路，成为近来研究的热点，本实验试图对这方面作出有益的探索。

    3.3  本实验的研究重点及结果

    　　以往的研究多采用腹腔或静脉注射途径。硬膜外注射也是临床给药的一种常规途径，只是其操作难度较大不如上面2种简单易行。但现在直接用药物来预防或治疗脊髓损伤已越来越多［19,20］，因为这样可以使药物直接作用于损伤局部，治疗作用更快更直接。在脑缺血缺氧损伤中直接注射促红细胞生成素入大脑可以减轻神经组织的损伤［21,22］。在脊髓损伤后应用EPO通过硬膜外注射途径来干预的实验情况鲜有报道，本实验对此作出了有意义的探索。

    Li 等［23］观察在大鼠脊髓压迫损伤后4～9  d,损伤部位(T8 、9) 及相邻节段(T7 、10) 白质有大量的胶质细胞凋亡,细胞主要是少突胶质细胞,而灰质的神经元不表现凋亡特征。Liu等［24］1997年报告发现在脊髓损伤Allen打击模型中损伤范围神经细胞凋亡在灰质区伤后6 h即有出现但数量较少，24 h增多，48～72 h维持在最高水平；白质区6 h可见，48～72 h维持在最高水平。作者先前的研究［25］结果与此相符合。所以本实验选择了在脊髓损伤最初48 h内进行药物干预及其相关蛋白的检测。

    　　在本实验中，作者检测了与凋亡密切相关的基因FasL、Caspase3在脊髓损伤后的表达情况，以及在促红细胞生成素干预脊髓损伤后的表达情况。试图来对促红细胞生成素起作用的机制进行进一步的研究。结果表明SCI后FasL与Caspase3表达均有不同程度的增高，损伤节段FasL伤后6 h～2 d均有较强的表达，损伤相邻节段FasL峰值延后出现，以后表达明显下降，提示FasL／Fas可能为启动因子之一；而Caspase3的表达情况与TUNEL染色所显示的凋亡出现的峰值规律相似，提示SCI后的细胞凋亡过程与FasL／Fas、Caspase3途径有关。易成腊等［26］通过RTPCR 检测到Caspase3mRNA从4 h开始增高,24～48 h达到高峰,而TUNEL 标记的阳性凋亡细胞8 h开始出现,72 h达到高峰,早于凋亡出现的时期,表明此时某些细胞已有凋亡信号始动。与TUNEL 所检测的阳性凋亡细胞在时间上相符。从Caspase3 阳性细胞先后出现的区域上看,也与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致,说明Caspase3 参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节。

    　　　从本实验的结果来看硬膜外注射途径给药是可行，并且是有效的。当然此途径与其他途径相比较，是否更具有优势，尚待进一步研究。数据表明凋亡细胞的发生与Fasl、Caspase3表达阳性细胞呈正相关，并且EPO干预后凋亡细胞及其相关蛋白的表达明显降低。可以看出,从脊髓损伤后到活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤的治疗时窗。Caspase3 在脊髓损伤后48 h内显著增高,可见应用基因干预或特异性Caspase 抑制剂宜在48 h内应用。

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作者单位：（1.苏州大学附属第二医院骨科，江苏 215004；2.苏州大学基础医学系病理教研室, 江苏 215123）