壳聚糖/羟基磷灰石支架修复骨软骨缺损的实验研究

【摘要】  ［目的］探讨双层壳聚糖（chitosan CS）/羟基磷灰石复合支架(hydroxyapatite HA)修复兔骨软骨缺损的可行性。［方法］采用冻干法和烧结法制作双层壳聚糖（CS）/羟基磷灰石（HA）复合支架，以骨髓间充质干细胞为种子细胞，运用纤维蛋白胶种植技术，以双层壳聚糖（CS）/羟基磷灰石（HA）复合支架为载体，修复骨软骨缺损，实验分3组，A组：BMSc+支架，B组：单纯支架，C组：未处理。将修复材料植入骨软骨缺损模型，分别于6、12周取材，进行大体观察，组织学检测，改良Wakitani法评分，经统计学处理，比较各组修复效果差异（P＜0.05）。［结果］（1）CS/HA支架CS层孔隙率为76%± 5.01%，孔径为200～400 μm,平均为300 μm左右，孔相通性好，HA层孔隙率为72%± 4.23%，孔径为200～500 μm,平均为350 μm左右，孔相通性好，结合部结合好；（2）P2骨髓间充质干细胞较纯，扫描电镜观察MSCs附着在复合支架上。大体观察和组织学检测显示， A组基本修复软骨缺损，骨缺损有骨小梁长入。B、C组骨软骨缺损修复不良，组织学检测以纤维性组织或无新生组织形成，软骨及骨缺损均明显存在，改良Wakitani评分显示A组在6周、12周2个时间点的各项评分结果，均优于B、C组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。［结论］双层壳聚糖（CS）/羟基磷灰石（HA）复合支架可作为骨软骨组织工程支架，结合BMSc可修复软骨与骨的缺损，重建关节的解剖结构和功能。

【关键词】  壳聚糖/羟基磷灰石复合支架; 组织工程; 骨髓间充质干细胞; 骨软骨缺损

　 Kingsouthwest2000@yahoo.com.cnRepair of articular osteochondral defects with CS/HA bilayered scaffold in  rabbits∥WANG Wenliang ,ZHANG Hualiang , GUAN Jing,et al. Department of Orthopedics, Affiliated Hospital, Medical College of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162,China

    Abstract：［Objective］To evaluate feasibility for the treatment of osteochondral defects on the femoral condyles by chitosan/ hydroxyapatite bilayered scaffold in rabbit knee joint.［Method］Bilayered scaffolds  were produced with chitosan and hydroxyapatite using a lyophilization and sintering method．The pore size and interpores of the scaffolds were observed by scanning electron microscopy(SEM)anhydrous ethanol substitution method  to determinate its porosity .Rabbit bone mesenchymal stem cells(BMSC) inoculated onto the scaffold． By SEM scanning，the condition of the cells adhering onto the scaffold was observed.The cellscaffold composite were implanted into an rabbit model of osteochondral defect 10 hour later．The result was observed 6 and 12 weeks later by HE staining and toluidine blue staining. ［Result］Physicochemical characterization of CS/HA bilayered scaffold:HA possessed a porosity of 72%± 4.23% CS layer possessed a porosity of 76%± 5.0% .SEM micrograph showed  CS pore at the typical transversal crosssection of CS layer with open pores and pore size with average 300 μm ranging from 200–400 μm and HA pore at the typical transversal crosssection of HA layer with open  pores and pore size with average 350 μm ranging from 200–500 μm。The FTIR data showed typical peaks of the CS and HA peaks and no typical peaks of polyethylene glycol peaks. It was observed by SEM that  BMSCs adhered on the chitosan scaffold and grew well but did not completely extend ,adhered on the HA scaffold and extended partially after BMSCs was implanted on the CS/HA scaffold 10 hours. The treatment of simple CS/HA scaffold improved defect filling compared with that left untreated, while the regenerated tissue  was mainly fibrocartilage and showed little bone formation.When implanted with CS/HA scaffold combined with MSCs, most of the defects were filled with a wellestablished layer of cartilage tissue with a little bone formation observed by HE staining and toluidine blue staining. Modified Wakitani grading scale showed that A group was superior to B、C groups in 6、12weeks. There were significant  differences (P＜0.05) between them.［Conclusion］The novel chitosan/ hydroxyapatite bilayered scaffold possesses porous structure and biocompatibility， and will possibly become a new biomaterial of osteochondral tissue engineering．

    Key words：chitosan/ hydroxyapatite bilayered scaffold;  osteochondral tissue engineering(TE)；  bone mesenchymal stem cells(BMSC);  bone defect

    目前软骨损伤生物学修复的金标准是自体软骨移植。尽管临床研究结果证实自体软骨移植大多数病例取得了很好的疗效，但生物学和临床上所面临的挑战是损伤软骨的完全修复和功能重建。目前仍有两个主要的问题需要重视：（1）有研究表明由于外伤，病理改变和因年龄等因素相关的关节软骨病变多伴随着软骨下骨的病变，而软骨下骨病变，又可以影响其上软骨的新陈代谢，形成恶性循环，加重软骨病变甚至发展为骨性关节炎，影响软骨的长期修复效果 ［1、2］；（2）新生的修复组织与周围宿主骨与软骨组织的相互整合的问题，即新生组织与宿主周围的骨软骨缺乏牢固的锚定 ［3］，目前大多数软骨组织工程并没有解决这个问题。为了解决这两个问题，本实验采用模拟关节骨软骨组织学结构的CS/HA支架，结合兔骨髓间充质干细胞，同时修复免膝关节骨软骨缺损模型。

    1  材料与方法

    1.1  动物及主要试剂

    CS/HA支架（自制，图1），日本大耳白兔，LDMEM培养基（sigma 美国）,优质胎牛血清（FBS）（血研所 天津）胰蛋白酶（sigma 美国）,纤维蛋白原  凝血酶原（sigma 美国）。

    图1  CS/HA支架的宏观结构

    1.2   实验方法

    1.2.1  双层壳聚糖（CS）/羟基磷灰石（HA）复合支架的制作及理化性质检测。

    　　称取CS溶于醋酸配成浓度为3%(w/v) 壳聚糖溶液,同时加入聚乙二醇，离心去除气泡。将HA支架先放入的模具中，取配好的壳聚糖溶液，倒入模具中成形，放入冰箱冷冻，在冷冻抽干机中冻干，制成壳聚糖/羟基磷灰石复合支架，中和支架内的醋酸溶液，反复PBS液冲洗，至pH值中性。分别用傅立叶红外光谱仪测定材料性质；乙醇替代法测量其孔隙率 ［4］，扫描电镜观察复合支架孔径的大小及内部结构。

    1.2.2  细胞支架复合物修复兔膝关节骨软骨缺损模型

    将支架泡入75%的酒精30 min，紫外线照射30 min消毒。收集兔自体P2代骨髓间充质干细胞（D1），调整细胞密度为2×107/ml，按文献 ［4］运用纤维蛋白胶种植技术体外构建细胞-支架复合体，将支架细胞复合物移入37℃、5%CO2及饱和湿度条件下孵育4 h，再缓慢地加入细胞培养液中。再在37℃、体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下孵育10 h，准备植入兔膝关节骨软骨缺损模型内。

    戊二醛固定支架细胞复合体，扫描电镜（SEM）观察细胞在支架上生长的情况。

    兔膝关节骨软骨缺损的制备及细胞-支架复合体的植入： 36只日本大耳白兔，3个月龄大小，体重2±0.2 kg,取右膝关节，共36膝，随机分为3组，每组12膝， A组，复合支架+干细胞，B组，复合支架，C组，未处理。肌肉注射速眠新0.2 ml/kg麻醉动物，常规消毒铺巾，依次切开膑韧带外侧缘，充分暴露股骨下端外侧髁负重区，在其上做一个直径4 mm，深度达3 mm的圆柱形缺损，钻穿软骨下骨，清除缺损内的血凝块后，置入细胞支架复合物或单纯支架或不作处理，无菌生理盐水冲洗关节腔，分层缝合。分别在6、12周取材，截取修复的股骨远端，4%多聚甲醛固定48 h，20%的EDTA钠盐脱钙3周、每周更换脱钙液2次，石蜡包埋切片。观察指标为：术后一般情况，修复组织大体观察，HE染色及甲苯胺蓝染色等组织学观察。并根据改良的Wakitani评分法进行半定量评分 ［5］。

    1.2.4  统计学方法

    　　采用SPSS11.0统计软件包进行分析，数据以均数±标准差表示，采用方差分析，SNK法进行两两比较，P＜0.05 为有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  双层壳聚糖（CS）/羟基磷灰石（HA）复合支架(图a)的理化性质检测

    2.1.1  CS红外图谱分析  3 363 cm-1左右的吸收峰是O-H和N-H的伸缩振动特征峰，在896 cm-1 左右处存在β 型糖苷键的特征吸收峰，图中并未发现聚乙二醇特征峰波，说明此红外图谱符合壳聚糖图谱(图2a)。HA红外图谱分析3 571.19 cm-1左右处和630.77 cm-1左右处分别为OH- 的特征吸收峰，在1 008.62 cm-1处的吸收峰较宽，属于PO3-4和H PO2-4多个吸收峰重叠的结果。说明此红外图谱为符合羟基磷灰石图谱(图2b)。

    2.1.2  根据公式P=（V1-V3）/（V2 -V3）测量其孔隙率。具体方法是用量筒量取V1体积的无水乙醇, 将CS、HA支架浸入其中，反复抽真空至无气泡逸出，此时量筒读数是V2，将含无水乙醇的支架材料移出后记所剩无水乙醇体积为V3。结果CS的孔隙率76%± 5.01%， HA的孔隙率72%± 4.23%。

    2.1.3  扫描电镜观察复合支架的超微结构  CS支架可见，支架内密布大小较为均一的大孔，中间有深层孔洞相通，大孔直径为200～400 μm,平均为300 μm左右，孔与孔之间有压缩的状态，呈长条形，可能与制样时CS支架采用的冻干法干燥样品有关(图3a)；HA支架可见，支架内大小较为均一的大孔，中间有深层孔洞相通，大孔直径为200～500 μm,平均为350 μm左右，HA 晶体较为粗糙(图3b)；CS/HA支架结合部可见，CS层紧紧贴附于HA层上，并渗透进HA层内，结合部CS层、HA层孔隙减小，可见CS层、HA层结合紧密(图3c)。

    2.2  细胞支架复合物修复兔膝关节骨软骨缺损模型

    2.2.1  BMSC在复合支架上的体外培养观察  MSCs附着在HA支架的MSCs部分伸展开来，并伸出细胞突起；附着在壳聚糖支架上，并未完全伸展开来。

    2.2.2  大体观察  术后6周观察。A组，缺损处被新生组织填充，修复面平整，或稍高，修复成组织类似正常透明软骨，与周围正常软骨组织之间隐约可见界限，按压时有抵抗感。（图5d）; B组,新生组织填充缺损处，但表面不平整，色泽显暗，与周围软骨界限明显，按压时抵抗感弱（图5b）;C组,缺损区有明显凹陷，缺损部位基本未见修复（图5c）。术后12周观察。A组，修复区表面平整光滑，与周围正常软骨不易区分（图5f）；B组，外观略有凹陷，色泽与周围组织接近但仍可区分（图5e）；C组，缺损仍明显，可见肉芽组织部分充填缺损（图5d）。

    图1  CS、HA支架的宏观结构  图2a、2b  CS和HA的红外扫描图谱  图3a、3b、3c  分别是CS层、HA层、CS与HA层结合部的微观结构（SEM）  图4a  P2代MSCs，细胞较纯  图4b  CS层复合上MSCs  图4c  HA层复合上MSCs（SEM）  图5a、5b、5c  分别是空白组、支架组、支架细胞组动物实验6周时取材表面修复情况  图5d、5e、5f  空白组、支架组、支架细胞组动物实验12周时取材表面修复情况。2.2.3  组织学观察  术后6周观察：6周时A组修复软骨与正常的关节软骨组织学上相似，表面有成熟的软骨组织，细胞数量多，排列无序，底层有幼稚软骨细胞增生活跃，且可见同源细胞群（图6a），软骨下骨区可见纤维囊样组织包裹HA，内有渗进HA支架的CS样物，炎症细胞较多，近骨小粱区可见成骨细胞，也可见少量新生组织（图6b）。B组可见少量软骨细胞（图6c）、大量的纤维组织样修复软骨缺损，软骨下骨区可见未降解的HA和渗透进HA的CS，内有大量的炎性细胞和少量的新生组织（图6d）。C组软骨区（图6e）与软骨下区（图6f）均由增生纤维组织填充。术后12周观察： A组修复软骨与正常的关节软骨组织学上基本相同，表面有成熟的软骨组织，细胞数量多、体积相对较大，出现柱样排列的细胞群，见典型的软骨陷窝样结构和同源细胞群，软骨周围为染色均一的玻璃样基质（图7a）。软骨下骨区可见HA仍未完全吸收，未见CS样物，炎症细胞较以前少，有少量骨小梁长入（图7b）， B组可见软骨细胞较以前增多，仍由纤维样组织修复软骨缺损（图7c），软骨下骨区可见未降解的HA内有大量的炎性细胞和少量的新生组织（图7d）。C组软骨区（图6e）与软骨下区（图7f）均由增生纤维组织填充。

    图6e、6c、6a  分别是空白组、支架组、支架细胞组动物实验12周时软骨修复情况（甲苯胺蓝），图7e、7c、7a  分别是空白组、支架组、支架细胞组动物实验12周时软骨修复情况（甲苯胺蓝）  图6f、6d、6b  分别是空白组、支架组、支架细胞组动物实验6周时软骨下骨修复情况（HE）

    图7f、7d、7b  分别是空白组、支架组、支架细胞组动物实验12周时软骨修复情况（HE），图中NC 指正常组织、RC指修复组织、IF指交界处。

    2.3  CS/HA支架复合体修复兔膝关节骨软骨缺损，改良Wakitani评分值A组优于B、C组，且有统计学意义(表2）。表2  改良Wakitani评分值注：*A组与C组比P<0.05,**A组与B组比P<0.05

    3  讨  论

    3.1  壳聚糖/羟基磷灰石支架作为骨软骨组织工程支架的可行性

    　　理想的骨软骨组织工程支架材料应具有以下特性:(1)良好的生物相容性及生物安全性；(2)三维立体结构孔隙率应达到90%以上,并具有很大的内表面积,孔隙直径平均为150 μm左右;(3)良好的表面活性，应能够促进骨软骨细胞粘附和增殖;(4)生物可降解性，支架在组织形成过程中应逐渐被降解,并且不影响新生成组织的结构和功能;(5)可塑性，可被加工成所需要的形状并具有一定的机械强度,并使新形成的组织具有符合设计的外形;（6）原料来源和价格具有商品化的前景 ［6］。壳聚糖是自然界广泛存在的一种天然多糖类有机聚合物，它的分子结构和软骨基质糖氨多糖(GAG)结构相似，具有良好的生物相溶性和可降解性，对软骨细胞有较好的吸附作用，可促进细胞在材料上的增殖与分化 ［7、8］，是软骨组织工程中较适宜的支架材料。Nettles等 ［9］将猪软骨细胞接种于冷冻干燥法制备的壳聚糖多孔支架中, 于旋转生物反应器中培养,经甲苯胺蓝及免疫组织化学检测,发现软骨细胞保持球形, 并有大量蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌。羟基磷灰石是人体骨的主要无机质成分，不仅能传导成骨，而且能与新骨形成骨键合，具有良好的生物相溶性。Brittberg等 ［10］认为HA含有的钙、磷成分在机体中可以产生轻微的溶解,溶解的钙、磷与周围骨组织的钙离子、磷离子形成化学键 ［11］,与周围的软骨下骨的骨原细胞紧密结合,随着时间的推移,骨原细胞逐步进入支架,并向骨细胞演变,长入HA的微小孔隙中,并逐步替代载体,恢复软骨下骨的正常结构。在我们的实验中，双层壳聚糖/羟基磷灰石支架具有合适孔径和孔隙率。适合组织工程支架要求，支架材料与细胞具有良好的相溶性，因此，壳聚糖/羟基磷灰石支架是骨软骨组织工程支架材料的理想选择。

    3.2  壳聚糖/羟基磷灰石支架的设计

    　　骨软骨组织工程旨在同时修复退变的骨软骨，是解决软骨退变的较理想的办法。骨软骨组织工程支架要求有类似于骨软骨组织学结构，即软骨样层和软骨下骨样层。Athanasiou等 ［12］最早提出“双相”载体，类似正常关节骨软骨的组织形态，疏松部分内部空间大，容纳的细胞多，软骨前体细胞接种后在这种三维体培养中相互作用，可形成关节面的软骨层。致密部分强度高，植入关节骨软骨缺损后可支撑新形成的软骨组织，起到软骨下骨板的作用。他构建的“双相”聚乳酸聚乙醇酸载体有相对致密的软骨下骨区和相对疏松的软骨区。我们的实验表明，CS模拟软骨样层，HA模拟软骨下骨层。结合自体骨髓间充质干细胞，软骨层得到了较好的修复，甲苯胺蓝异染性强，修复以透明软骨为主；软骨下骨层得到了部分修复，可能是时间不够和HA降解慢的原因造成的。但实验组优于对照组说明骨髓间充质干细胞复合在HA上是可以修复软骨下骨的。

    3.3  体内微环境诱导支架细胞复合物修复骨软骨缺损。

    将骨髓间充质干细胞和支架复合体修复骨软骨缺损是需要一定的外界环境。国外有学者将细胞支架复合体在体外环境下诱导成骨与软骨。Mauney将MSCs复合在部分矿化的三维支架上，置于骨诱导液在动态生物反应器中培养，培养16 d后碱性磷酸酶活性高于静态对照组，说明动态生物反应器中应力刺激下有利于MSCs向成骨方向分化 ［13］。Chang设计了一种能够培养双相支架细胞复合物的双室生物反应器，用于同时体外构建软骨组织，体外培养4周后发现软骨细胞形成 ［14］。MSCs向软骨及骨方向诱导分化是综合性因素。在体外难于完全模拟出合适的诱导环境，体内微环境是MSCs诱导分化的天然环境，它包括各种生物因子，理化刺激，力学环境等因素，因而有学者提出了体内生物反应器的概念，即要充分利用体内局部的如血运、各种理化因子刺激种子细胞等等来以更高的速度和更好的质量形成新的目的组织。Stevens用胫骨和骨膜制作了一个空间，利用此空间含有的丰富的间充质干细胞，用于自体内修复机制组织工程化新组织骨，用于对侧胫骨缺损的修复。本实验采用冻干法，预先将CS/HA支架连接在一起，复合自体骨髓间充质干细胞，利用体内生物反应器，自体的间充质干细胞能够在关节腔中乏氧、支架三维结构、高密度、多种生长因子的共同作用下向软骨方向转化。在骨髓腔中丰富的血供、高氧、高密度、多种生长因子的作用下向成骨方向分化。术后动物自由活动，给予力学刺激，也可促进MSCs的分化。术后12周，CS层降解被软骨层替代，HA层部分降解，有新的骨小梁长入说明了CS/HA支架起到一个载体的作用，可以修复骨软骨缺损。

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作者单位：武警医学院附属医院骨科，天津 300162