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【摘要】 ［目的］通过体外实验验证RNAⅢ抑制肽（RIP）能否抑制葡萄球菌在人工关节材料表面黏附，探讨其用于人工关节感染治疗的可行性。［方法］制作超高分子聚乙烯、钛合金和钴铬钼合金试样，葡萄球菌经FITC标记，人工关节材料试样消毒后接种FITC标记的葡萄球菌，每种试样4组，分别为空白组、RIP组、左氧沙星组和联合组，将含有细菌、试样和药物的24孔板在37℃下孵育30 min后，用荧光显微镜观察。［结果］三种材料的用药组细菌光点计数（P＜0.001）和覆盖面积（P＜0.05）均显著低于空白组；左氧组细菌光点计数少于RIP组，但两组的细菌覆盖面积无差别；联合组光点计数和细菌覆盖面积均少于左氧组和RIP组，差别显著（P＜0.01）。［结论］RIP可以抑制表皮葡萄球菌对关节假体材料表面的粘附，如果与抗生素联合应用可以起协同作用。
【关键词】 人工关节； 感染； 葡萄球菌； 黏附； RNAⅢ抑制肽
Experimental study on the effects of RNAⅢ inhibiting peptide in inhibiting the adhesion of staphylococcus to joint implant material surface in vitro∥HAO Li-bo,XING Qing-chang,WANG Ji-fang,et al.Orthopaedic Department of PLA General Hospital.Beijing,100853,China
Abstract: ［Objective］To investigate the inhibiting effects of RNAⅢ inhibiting peptide (RIP).On the adhesion ability of staphylococcus on joint implant material surface,determine the feasibility of RIP on prevention and treatment of infection from total joint replacement. ［Method］Staphylococcus cells were marked with FITC,and cultivated together with commonly used biomaterials:Ti alloy,CoCmo alloy,and UHMWPE.Photos were taken twith fluorescence microscope and analyzed with Photoshop 9.0 and Image pro plus 6.0 software to study the adhesion difference between control,RIP ,Levofloxacin,and RIP+Levofloxacin groups.［Result］RIP significantly reduced cell adhesion to the joint implant material surface(P Key words：total joint arthroplasty; infection; staphylococcus; adhesion; RNAⅢ-inhibiting peptide 人工关节置换术后感染诊断治疗困难，主要原因是细菌在假体表面形成生物被膜，生物被膜保护细菌对抗不利的外界环境，阻止抗体、细胞和抗生素杀灭被膜内细菌，而且生物被膜不易被清除，导致感染迁延不愈和必须取出假体［1～3］。细菌黏附在假体表面是生物被膜形成的始动阶段，也是最重要的阶段，抑制细菌的黏附则可以抑制生物被膜形成，对于预防和治疗关节置换术后感染具有重要意义［3］。 细菌生物被膜形成过程受 “群体感应信号(quorum sensing，QS)”机制调节［4］。抑制这一细菌间的信号调节机制以抑制细菌的黏附、生物被膜形成和毒素分泌，进而预防和控制感染，是一条有别于抗生素的感染治疗新途径［5］。RNAIII抑制肽(RIP)是最近发现的葡萄球菌QS有效抑制剂，具有预防和治疗葡萄球菌感染的潜在价值［6、7］。本研究拟通过体外实验验证RIP能否抑制葡萄球菌在人工关节材料表面黏附，探讨其用于人工关节感染治疗的可行性。 1 材料和方法 1.1 人工关节材料试样 超高分子聚乙烯、钛合金和钴铬钼合金试样由北京力达康公司加工制作，直径10 mm，厚度2 mm，各24枚，表面抛光(图1)。 1.2 细菌标记 表皮葡萄球菌ATCC 35984源自Naomi Balaban，由上海复旦大学范长胜教授转赠。挑取单个菌落接种于50 mlTSB培养基内，在37℃、150 r/min培养箱中摇晃过夜。取20 ml对数生长早期菌液，离心后从上清液收集细菌，悬浮于含10 mg FITC、由1.5 mlPBS和10.5 ml碳酸氢钠(0.5 mol/L pH 9.5)组成的混合溶液中进行FITC标记，大幅度搅拌菌液，4℃培养过夜。用0.5 mol/L碳酸氢钠溶液将菌液离心洗涤3次，用比浊仪调配成0.5 Mc的PBS菌液备用。 1.3 RIP合成 有机化学固相Fmoc法合成RIP，由C端至N端合成，即将该多肽C端的第一个Fmoc-AA的羧基活化后与HMP树脂结合，再脱去Fmoc-保护基，与第二个羧基活化的Fmoc-AA结合，循环重复，直至合成肽树脂。然后用TFA将合成的肽从肽树脂上切下，得到粗品肽。应用Waters600高效液相色谱仪对合成得到的RIP粗品进行纯化，洗脱系统为：①A液：50 ml/L乙腈／H2O溶液；②B液：950 ml／L乙腈／H2O溶液。手动加样，每次1 ml，流速4 ml／min，线性梯度，30 min。B液从50 ml/L增加至500 ml/L，然后在5min内增加到950 ml/L，B液做最后洗脱。用紫外分光光度计在214 nm波段检测吸收光谱，按峰收集组分，冻干，制成纯品RIP备用。 1.4 粘附实验 人工关节材料试样在121℃温度下高压消毒25 min，烘干后放入无菌24孔板内。将FITC标记的细菌细胞按1∶100用PBS液稀释，按106个细菌(900 μlPBS)／孔的标准将菌液滴入24孔板内。分组如下：超高分子聚乙烯、钛合金和钴铬钼合金试样各24枚，分为4组，每组各6枚。4组分别为空白组、RIP组、左氧沙星组和联合组，空白组每孔内加入50 μl含0.75%DMSO的生理盐水，RIP组每孔加入50 μl含有浓度为lmg／mlRIP的0.75%DMSO溶液，左氧氟沙星组每孔加入50 μl含100 μg左氧氟沙星的水溶液，联合组用药剂量参照上述两组。将含有细菌和试样的24孔板在37℃下孵育30 min，取出材料试样，PBS冲洗后，用荧光显微镜在400 nm波段进行观察、拍照。 1.5 图像采集和数据处理 在40倍物镜下用荧光显微镜拍照，采用image pro plus 6.0软件对数字图像进行荧光光点计数和荧光覆盖面积比计算，结果为细菌数和细菌覆盖面积。获得的结果以均数±标准差(x-±s)表示。采用SPSS 13.0软件进行t检验，a=0.05为检验标准，P<0.05为差异有显著性。 2 结果 三种材料的用药组细菌光点计数(P<0.001)和覆盖面积(P<0.05)均显著低于空白组；左氧组细菌光点计数少于RIP组，但两组的细菌覆盖面积并无差别；联合组光点计数和细菌覆盖面积均少于左氧组和RIP组，差别显著(P<0.01)(表1、2、3和图2、3、4)。 表1 RIP对表皮葡萄球菌在超高分子聚乙烯表面粘附的影响分组细菌对材料表面的粘附注：与空白组相比◆P<0.05，◆◆P<0.01，◆◆◆P<0.001； 与RIP组相比●P<0.05，●●P<0.01； 与左氧组相比P<0.05，P<0.01。 (下同)表2 RIP对表皮葡萄球菌在钛合金表面粘附的影响分组细菌对材料表面的粘附表3 RIP对表皮葡萄球菌在钴铬钼合金表面粘附的影响分组细菌对材料表面的粘附 3 讨论 生物被膜对人工关节置换术后感染可能起到如下影响：（1）生物被膜是引起关节置换感染的原因之一，多数关节置换术后感染是慢性感染，其始动环节是手术当中污染的细菌，这些细菌在假体表面黏附并形成生物被膜，被膜内细菌无法被杀灭，逐步发展成感染；（2）生物被膜增加了感染诊断的难度，生物被膜感染的细菌局限在被膜内，常规培养方法，如穿刺培养等很难采集到细菌；（3）生物被膜使感染治疗困难，尤其是人工关节感染，如不取出假体并彻底清创，一般很难治愈。基于上述分析，作者认为，抑制细菌在假体表面形成生物被膜对预防和治疗人工关节置换术后感染具有价值。 细菌黏附在内植物表面是生物被膜形成的起始步骤，如果能够抑制细菌在假体表面的黏附，则可抑制生物被膜形成。但是目前抑制细菌黏附的方法不多，包括：（1）植入体内的假体必须非常洁净，在植入时才从包装内取出，最大限度减少细菌的黏附；（2）设计能够抵抗细菌黏附的内植物材料，如在内植物材料内加入银离子；（3）在内植物材料表面涂层抗生素。上述方法效果均有限［7、8］。 图1常用骨科内植物材料（从左到右依次为钛合金、高分子聚乙烯、钴铬钼合金） 图2RIP对表皮葡萄球菌在聚乙烯材料表面粘附的影响 图2a空白组（246，1.33%，×40） 图2bRIP组（127，0.78%，×40） 图2c左氧组（69，0.161%，×40） 图2d联合组（49，0.076%，×40） 图3RIP对表皮葡萄球菌在钛合金材料表面粘附的影响 图3a空白组（338，2.75%，×40） 图3bRIP组（192，1.77%，×40） 图3c左氧组（43，0.72%，×40） 图3d联合组（12，0.62%，×40） 图4RIP对表皮葡萄球菌在钴铬钼合金材料表面黏附的影响 图4a空白组（293，2.86%，×40） 图4b左氧组（74，1.48%，×40） 图3cRIP组（98，0.61%，×40） 图4d联合组（13，0.23%，×40） RNAⅢ抑制肽(RIP)是一种人工合成的7肽，可以抑制葡萄球菌的QS系统，体外研究和动物实验证明RIP治疗葡萄球菌感染有效，而且一些研究证明RIP能够抑制葡萄球菌在人上皮细胞和塑料表面的黏附。本研究目的是验证RIP抑制葡萄球菌在人工关节材料表面黏附的作用。结果显示各用药组的聚乙烯、钛合金和钴铬钼合金表面荧光光点个数和细菌覆盖面积均明显少于空白组，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.001)，而联合用药明显优于单用RIP和左氧氟沙星。上述结果说明RIP可以抑制表皮葡萄球菌对关节假体材料表面的粘附，如果与抗生素联合应用可以起协同作用。需指出的是，尽管左氧组的荧光光点计数要明显少于RIP组(P<0.05)，但在细菌覆盖面积方面两组并无明显差别(P>0.05)，这一结果在某种意义上说明在局部抗生素作用下细菌更趋向于聚集生长、黏附和形成生物被膜，加强自身的保护作用，而抗生素虽能杀灭浮游细菌，但抑制细菌黏附和形成生物被膜的能力较有限，更难以杀灭被膜内细菌，因此应用抗生素同时复合能够抑制细菌黏附和形成生物被膜的RIP对预防和治疗感染非常有意义。 RNAⅢ抑制肽(RIP)作用机理如下［7～11］：葡萄球菌的群体感应机制被缩写为SQS，该机制在细菌增殖早期控制细菌表达黏附分子，促进细菌在内植物表面黏附，在增殖中晚期调整其表达，使细菌分泌毒素，引起症状。已发现葡萄球菌有两套QS通路，SQSl和SQS 2［6］。SQSl由自诱导肽-RAP及其目标分子TRAP组成。细菌在增殖时开始分泌RAP，RAP达到阈值浓度后使TRAP发生组氨酸磷酸化。TRAP磷酸化通过一种未知机制激活基因调控系统agr，后者编码第二套群体感应系统-SQS2。SQS2由agr的产物组成。Agr编码两种转录方向不同的转录物RNAⅡ和RNAⅢ。RNAII编码AgrA、B、C和D。AgrD是一种自诱导前肽，在细菌增殖的冥数阶段中期自动分泌，修饰为一种八肽-AlP，AgrB协助AlP产生和分泌，AgrC和AgrA是一个二组分系统，AgrC为AlP的感受器，AgrA为调节器。一旦agr系统被激活并开始分泌AIP，将引起AgrC的磷酸化，导致RNAⅢ产生。RNAⅢ调节毒素(如肠毒素B、C、D和溶血素以及休克综合症毒素-1)和细胞表面蛋白(如蛋白A和纤连蛋白)的分泌。RNAⅢ抑制肽(RIP)与RAP结构相似，竞争性抑制TRAP的磷酸化，从而阻碍葡萄球菌的QS系统发挥作用 【参考文献】 作者单位：解放军总医院骨科，北京
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