模拟微重力环境下层状修复体与软骨细胞复合培养的实验研究

【摘要】  ［目的］探讨模拟微重力作为软骨组织工程培养方法的作用和胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙（trical cium phosphate，TCP）层状梯度修复体作为关节软骨组织工程支架的可行性。［方法］体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞并扩增,吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上，模拟微重力和普通环境下三维立体分别培养3周,通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测微重力对软骨细胞培养的影响和支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。［结果］软骨细胞/修复体体外培养3周,软骨细胞模拟微重力培养组明显比普通培养组在层状修复体上分布均匀，修复体中心软骨细胞数量明显较多，并分泌细胞基质，包裹在软骨细胞周围，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。［结论］模拟微重力环境有利于软骨细胞在三维支架上的均匀增殖，有望成为软骨组织工程中的一种重要培养方法；胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体，细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。

【关键词】  微重力; 层状修复体; 软骨细胞; 组织工程

Study of chondrocyte on the layered scaffold under minic microgravity culture∥ZHANG Shihao,ZHU Lixin,JIN Anmin,et al.Orthopedic Department,Zhujiang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510282,China

    Abstract：［Objective］To evaluate the feasibility of the minic microgravity as a method and the layered cylindric collagenchitosanβtricalcium phosphate composite as a scaffold for the cartilage tissue engineering after an observation of how it absorbs the chondrocytes and affects the cell behavior.［Method］The chondrocytes were isolated and multiplied in vitro,and then the chondrocytes were seeded onto the  porous collagenchitosanβtricalcium phosphate composite scaffold and were cultured in both minic microgravity and ordinary environment for 3 weeks.The effects of the composite scaffold on the cell adhesivity,proliferation,morphological changes and synthesis of the extracellularmatrix were observed by the growth curve,phasecontrast microscopy,histology,scanning electron microscopy and immunohistochemistry.［Result］The chondrocytes that adhered to the scaffold increased significantly and secreted  extracellular matrix in the center of the porous scaffold around the chondrocytes under minic microgravity compared with ordinary environment.Immunohistochemistry of type Ⅱ collagen was positive.［Conclusion］The minic microgravity environment will be a good method for the cartilage tissue engineering.And the layered cylindric collagenchitosanβtricalcium  phosphate composite scaffold has a good cellular compatibility.It will be an ideal scaffold for the cartilage tissue engineering.

    Key words：microgravity；  layered composite；  chondrocyte；  tissue engineering

    关节软骨损伤一直是骨科面临的难题之一。关节软骨本身缺乏营养血管，再生细胞和体液因子少，软骨的细胞/基质比低，一旦关节软骨损伤，其再生能力十分有限。此外，再生软骨的生物化学和机械性能不等同于正常软骨，容易退变和侵蚀。组织工程修复软骨手段的目的是将修复物质运送到受损部位并且固定于该位置以达到有效的修复 。从研究结果来看，虽然研究者们应用了多种方法研究生物材料、种子细胞和修复，但修复关节软骨的长期效果并不令人满意，存在着组织工程软骨中心强度低、难以和宿主正常软骨整合、软骨和软骨下骨的断裂分层问题等难题［1～3］。作者希望通过最近新兴的模拟微重力技术，将软骨组织工程中应用广泛的胶原、壳聚糖与βTCP有机复合,模仿体内关节软骨的分层结构,增加支架材料的力学强度，构建层状梯度复合材料，并将扩增的兔关节软骨细胞植入其中人工培养,观察软骨细胞在胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体中的黏附、增殖、生长情况及生物学性状变化,以评价微重力培养方法在软骨组织工程的实用性及该复合材料作为关节软骨组织工程支架的可行性。

    1  材料和方法

    1.1  主要试剂和仪器

    DMEM/F12、DHank’s 、胰蛋白酶、EDTA (Sigma公司，美国)；Ⅱ型胶原酶(Gibco公司，美国)；胎牛血清（杭州四季青公司）；四氮唑蓝（上海思吉生物制品有限公司，中国）、Ⅱ型胶原抗体、S-100抗体、SABC试剂盒（武汉博士德公司）；12、24孔培养板（CorningCostar公司，美国）；旋转培养仪（Synthecon公司，美国）；离心机（Sigma公司，美国）；酶标测定仪（Metertech公司，台湾）；CO2培养箱（Heraers Hera cell，德国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；胶原/壳聚糖/β磷酸三钙层状梯度修复体由华南理工大学材料学院制作提供，直径5 mm，高5 mm圆柱形，上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,两层之间逐渐过度，没有明显界限，平均孔径为100 μm,孔隙率≥90%。

    1.2  兔关节软骨细胞体外分离培养

    1.2.1  软骨采集  3周龄新西兰大白兔1只,体重0.5 g (南方医科大学实验动物中心提供,许可证号：SCXK(粤)2006-0015) ,10％水合氯醛静脉注射麻醉,无菌条件下削取双侧股骨髁、胫骨平台、股骨头及肱骨头的关节软骨,切取厚度1～2 mm,不超过软骨下骨板,软骨片切成 5 mm×5 mm大小,将切取的软骨片置于DHank’s中(含青、链霉素各100 U/ml)。

    1.2.2  软骨细胞悬液的制备  在超净台内用DHank’s冲洗取下的软骨片3遍,修剪至1 mm3大小,移入离心管内,加入5倍量的0.25%胰蛋白酶于37℃振荡下消化30 min,移出胰蛋白酶液,DHank’s冲洗2 次。加入0.2% Ⅱ型胶原酶8 ml ,37℃下消化4 h。将消化的细胞悬液经200目金属滤网滤过并移至离心管内,加入DHank’s离心(1 000 r/min,10 min),弃上清液,加入5 ml DMEM/F12 培养液,充分吹打成细胞悬液。细胞计数板计数,台盼蓝拒染检测分离软骨细胞活性。

    1.2.3  软骨细胞单层培养  将细胞按4×105/瓶接种于培养瓶,加入4 ml DMEM/ F12 完全培养基(含10%胎牛血清,青霉素100 U/ ml ,链霉素100 U/ ml) ，置于5 % CO2 ,37 ℃恒温箱内培养,隔日换液,倒置显微镜下观察软骨细胞的生长情况,当软骨细胞融合成片时进行传代。培养的第2、3代细胞行S－100免疫细胞化学染色。

    1.3  修复体预处理

    胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体经环氧乙烷消毒备用，实验前取12个置于12孔培养板,DHank’s洗3遍,每次20 min,再用DMEM/F12 液浸泡过夜。

    1.4  细胞和支架复合普通培养

    选择生长状态良好的第2、3 代细胞消化离心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成软骨细胞浓度为 1×107/ml,滴入经DMEM/F12液预湿的复合支架中,每个支架加入300 μl，将培养板放入5%CO2浓度、饱和湿度、37℃培养箱内30 min，然后每孔加入1.0 ml DMEM/F12完全培养基继续培养。隔日换液,培养3周， 进行相关检测。

    1.5   细胞和支架复合模拟微重力培养

    　　选择生长状态良好的第2、3 代软骨细胞消化离心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成软骨细胞浓度为 1×107/ml,滴入经DMEM/F12液预湿的复合支架中,每个支架加入300 μl，置于孵箱中30 min后将细胞支架复合物放入微重力旋转培养仪中，加满DMEM/F12完全培养基，置于5%CO2浓度、饱和湿度、37℃培养箱内继续培养。隔日换液1/3,培养3周,进行相关检测。

    1.5  检测指标

    1.5.1   倒置显微镜观察  对单层培养的软骨细胞及其修复体/软骨细胞每2 d行倒置显微镜观察。

    1.5.2  免疫学检测  取原代80%融合的软骨细胞玻片，进行Ⅱ型胶原免疫组化化学染色。

    1.5.3  生长曲线  软骨细胞接种到材料上后用MTT比色法检测生长曲线，对照组为没有接种细胞的修复体。方法为两组分别6例/次，隔日1组，共9次。以时间为横坐标，每组6孔吸光度的平均值为纵坐标，绘制生长曲线。

    1.5.4  扫描电镜观察  细胞接种后3周,两组分别取出8例修复体/软骨细胞复合物,2.5%戊二醛固定,系列脱水,乙酸异丙酯置换,临界点干燥,表面喷金后扫描电镜下观察。

    1.5.5  组织学和免疫组织化学检测  细胞接种培养3周后,两组分别取8个修复体/软骨细胞复合物,以4%中性福尔马林固定,系列脱水,石蜡包埋、切片,行HE染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,光镜下观察。

    2  结  果

    2.1  软骨细胞形态

    体外单层培养的软骨细胞刚接种时呈球形,悬浮在培养液中,24 h后开始贴壁,细胞呈扁平状,大多数为三角形，少量多角形,48 h后可见细胞分裂相,约1周后细胞铺满培养瓶瓶壁,折光度降低,呈“铺路石”样（图1）,可进行传代。第2、3代细胞S－100免疫细胞化学染色胞浆内呈阳性反应（图2）。

    2.2  生长曲线

    软骨细胞和材料复合后，除第1 d两组之间无显著性差异外（P=0.857），其余6个时间点两组之间有显著性差异（P=0.007,0.002,0.001,0.000,0.000,0.000），微重力组均比培养板组增殖力高。证明模拟微重力比普通培养更好地促进了细胞的增殖（表1，图3）。 

    2.3  扫描电镜

    培养3周后,普通培养组软骨细胞成团地吸附于支架表面,从切开的材料上可以观察到有部分细胞吸附于空隙内，细胞间通过突起相互连接,或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上(图4a)；模拟微重力培养组中细胞在修复体上分布更加均匀，且其中心部位软骨细胞数量明显比普通培养组多(图4b)。

    2.4  HE染色和免疫组化结果  3周后,模拟微重力培养组修复体表面可见大量细胞黏附成层状,中心部位亦可见细胞聚集成团;细胞呈圆形或椭圆形,细胞团中有基质分泌,沉积于细胞周围；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应（图5b、6b），普通培养组支架表层软骨细胞较多，中心细胞明显数量较少（图5a、6a）。表1  MTT法检测2种培养方式对软骨细胞促增殖作用测定结果注：OD 值（波长＝570 nm）

    图1   原代软骨细胞 （×40）  图2  软骨细胞S100 免疫细胞化学染色（SABC法）（×100）  图3  修复体上软骨细胞不同培养条件下的生长曲线  图4a  普通培养组软骨细胞/支架扫描电镜（×500）  图4b  微重力组软骨细胞/支架扫描电镜（×500）  图5a  普通培养组细胞/修复体HE染色 （×400）  图5b  模拟微重力培养组细胞/修复体HE染色  图6a  普通培养组软骨细胞/支架Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（SABC法）（×400）  图6b  微重力培养组软骨细胞/支架Ⅱ型胶原免疫组织化学染色（SABC法）（×400）

    3  讨  论

    旋转式细胞培养系统（RCCS）源自美国航空航天局,是一种绕水平轴旋转、充满液体,通过气液两相膜进行气体交换的圆柱形旋转壁式生物反应器( rotating wall vessel bioreactor,RWVB) ,其培养室旋转带动容器内培养液和培养物一起做旋转运动。通过调整旋转速度可实现RCCS中的培养液和培养物与容器壁同步旋转,当载体上的细胞增殖聚集后,增加旋转速度以抵消增加的沉降率。此时,培养物在水平轴上建立了近似均质液体的悬浮轨道,重力向量持续随机分布,使培养物维持在连续的自由落体状态,作用于细胞的表观重力降到大约10～2 g［4,5］,在地面上模拟了类似太空的微重力环境。

    　　在RCCS模拟的微重力环境中,共轴氧合器提供了充分氧合,高效物质交换能力为高密度细胞培养提供良好的培养环境；液体与固体微粒的同步移动使其受到的剪切力很小［6］,作用于单个微粒(细胞/微载体)的流体剪切力<0.05 Pa；培养液通过旋转逐渐混合,使内部环境均匀、物质传递能力强，这使得细胞在模拟微重力环境下比在普通重力环境中更快更好的增殖，使细胞在三维支架中得以更均匀的分布。本研究中,三维支架材料上细胞增殖达到峰值时,RCCS中的培养时间比普通培养组提前了将近1周，且其细胞密度明显大于普通培养组。尤其重要的是模拟微重力培养组的支架材料中心细胞明显多于对照组。这一特点克服了传统培养中三维支架材料中心细胞密度不够、修复强度低的难题。

    胶原是软骨组织中天然发生成分，胶原纤维与细胞外基质中其他成分形成结构与功能的复合体，具有无抗原性,生物相容性好,有利于细胞黏附、增殖和分化,与细胞外基质结构相似等特性,参与组织的修复过程。但胶原存在加工性能差、缺乏柔韧性、抗拉强度低、降解过快等缺点,单独用作软骨细胞培养基质材料难以达到理想的要求。而胶原的纤维强度和降解速度可以通过与其他材料的组合而变得可控［7］。

    壳聚糖是一种结构与细胞外基质中的主要成分糖胺聚糖(GAGs)十分类似的优良生然生物材料。由于壳聚糖所具有的独特分子结构、化学性质及良好的生物相容性、可吸收性、易于加工成型性等众多优点,非常适合作为组织和器官再生的细胞模板材料［8］ 。但也有研究文献［9］指出壳聚糖的细胞亲和力不够理想,需要对其改性或与其它材料复合来加以改善,使其更有利于细胞的黏附与增殖。

    将胶原与壳聚糖复合,使得制备的壳聚糖复合支架上分布有大量的胶原纤维丝构成的网,很容易黏附细胞生长,复合使支架对细胞的亲和力得到了改善，而且,复合时壳聚糖的游离氨基还可以和胶原的羟基之间发生交联反应,使支架的强度提高,同时,壳聚糖带正电荷,胶原带负电荷,两者可自然地通过静电相互作用,胶原的降解也因此得到延缓［10］ 。

    临床上软骨缺损常伴有软骨下骨损伤，使其正常结构受到破坏,导致软骨力学性能的改变,最终使修复组织早期愈合率降低并出现退变。因此，在修复软骨缺损的同时需修复软骨下骨，将骨与软骨组织工程结合起，构建骨软骨双层支架，或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨具有更现实的意义［11］。将生物降解陶瓷材料βTCP引入支架，利用其较强的力学性能，可以有效解决以上难题。βTCP主要成分与人骨的无机成分相似，具有骨诱导作用和良好的生物相容性；其轻度溶解所形成的高钙离子层及微碱性环境，可有效促进成骨细胞的粘附、增殖及分泌基质。Vicente 等［12］应用20只新西兰大白兔胫骨、股骨植入实验,测试βTCP/胶原和单纯βTCP材料的骨结合性能,发现βTCP/胶原复合物与单纯βTCP 比较,复合物的吸收更完全,虽然成骨能力与βTCP 相当,但吸收速度却更快。

    基于以上认识，作者首次构建了模拟体内关节软骨分层结构的胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体。作者的实验结果显示该层状梯度修复体亲水性良好；具有三维多孔立体结构,有可塑性,能被加工成所需的形状；扫描电镜结果显示修复体上下层之间没有明显界面,连成一个整体,平均孔径为100 μm,孔隙率≥90%，达到了软骨组织工程所需的载体条件；软骨细胞接种后，不仅能在其中黏附和生长,分泌Ⅱ型胶原,且能从表层伸出多个伪足样突起,紧密贴附于材料表面,沿材料的孔隙迁徙到内部生长，尤其是在模拟微重力培养组中，支架材料中心有更多的细胞增殖和分泌基质。说明修复体具有良好的生物相容性和细胞亲和性,细胞可以在其中保持其正常功能和稳定的表型表达。

    此外，RCCS也存在一些不足,其提供的模拟微重力环境在旋转培养过程中还存在碰撞、剪切力等因素的影响;由于设计原理的限制,RCCS的旋转半径不可能很大,影响了其培养规模;RCCS的价格昂贵,使用较繁琐。新一代的循环灌注式RCCS虽然部分解决这些问题,但仍值得深入研究；另一方面,该材料在体内降解情况及修复关节软骨缺损效果尚需进行体内实验进一步观察研究。

    综上所述,模拟微重力的培养体系可以促进软骨细胞在胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体内实现更快和更均匀的增殖，是软骨组织工程一个更好的培养方法；而修复体模拟了正常关节软骨分层结构,体外实验证实能促进软骨细胞在材料表面黏附，并维持了细胞正常形态和功能,是较理想的软骨组织工程支架。

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作者单位：1.南方医科大学珠江医院骨科中心，广州；2.华南理工大学材料科学和工程学院，广州