维拉帕米在应力对体外骨髓间充质干细胞早期反应基因蛋白表达中作用的研究

【摘要】  ［目的］研究维拉帕米(Verapamil)在周期性牵张应力对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)早期反应基因蛋白表达中的作用，从而进一步推断出Ca2+ 通道在细胞响应力学的信号传导途径中的作用。［方法］分离并培养骨髓间充质干细胞，利用体外细胞牵张应力装置对第3～6代细胞加载力学信号，在应力干预细胞前加及不加钙离子拮抗剂（维拉帕米），受力结束后，流式细胞术检测细胞内钙离子荧光强度，用RTPCR以及免疫组化的方法检测各组细胞内cfos、cjun和cmyc基因蛋白表达的情况。［结果］加载力学信号后，细胞内钙离子浓度发生改变，cfos、cjun和cmyc基因蛋白的表达明显增强(P<0.01)，经维拉帕米预处理后，以上生物学效应受到抑制(P<0.01)。［结论］在牵张应力作用下骨髓间充质干细胞Ca2+内流发生了变化，并且这种变化在骨髓间充质干细胞对周期性牵张应力的早期应答反应中起到了部分作用,可能依赖钙离子通道的活化来调控。

【关键词】  骨髓间充质干细胞； 牵张应力； cfos； cjun； cmyc； 维拉帕米

 Effects of verapamil on the immediateearly gene expression of bone marrow mesenchymal stem cells stimulated by mechanical strain∥LI Runguang,SHAO Jingfan, WEI Mingfa,et al.Department of Orthopaedics and Traumatology， Nanfang Hospital， Southern Medical University，Guangzhou 511700，China

    Abstract：［Objective］To study the effects of verapamil on the immediateearly gene(IEGs) expression of bone marrow mesenchymal stimulated by mechanical strain,and deduce the effects of calcium ion channel on the early responses of children bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs)to mechanical strain in vitro.［Method］MSCs were isolated and cultured.The 3-6th generational MSCs were stimulated in different time by mechanical and (or) verapamil（20μmol/l）.Flow cytometry was applied to measure intracellular free Ca2＋ at once.Earlyresponse genes /proteins （cfos,cjun and cmyc）were examined by RTPCR and immunocytochemical stain.［Result］The application of mechanical strain  increased intracellular cfos,cjun and cmyc mRNA /protein levels.The resulting effect is partially inhibited before MSCs were preincubated with verapamil (P<0.01).［Conclusion］Mechanical strain could change intracellular free calcium ion concentration of bone marrow mesenchymal stem cells,which was partially inhibited by verapamil,and the change playes a key role in early response of MSCs  to mechanical loading.

    Key words：mesenchymal stem cells (MSCs);  strain;  cfos;  cjun;  cmyc;  verapamil

    力学因素在各种组织细胞中起重要的调控作用。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，MSCs）是体内成骨和骨重建的细胞学基础。体外研究表明，适当的应力可促进MSCs增殖及向成骨分化［1、2］，而过度的应力则对MSCs造成一定的损伤［3、4］。细胞响应机械应力的早期反应相当复杂［5］。钙离子被认为是细胞内最重要的第二信使之一，对细胞各种生理活动具有广泛调控作用。胞内Ca2＋极少，当细胞受到理化因素等外界刺激后，胞浆Ca2＋浓度大幅度增加。cfos、cjun、cmyc等是细胞响应力学信号的重要中间产物，受刺激后短时间后即可检测到这些基因转录的mRNA。但这些基因诱导表达非常短暂，其mRNA寿命也很短，而且诱导这些基因不依赖于新蛋白的合成，故也称之为早期反应基因，它们能够激活下游调节分泌蛋白酶细胞因子，启动促进细胞增殖分化等生物效应。维拉帕米（Verapamil）是一种选择性钙拮抗剂，能阻断L型Ca2＋通道。在加载力学信号的培养细胞中加入一定浓度的Verapamil预处理，观察其在MSCs内Ca2＋以及早期反应基因表达的情况，以推断细胞响应应力的早期反应依赖于钙离子通道的活化。

    1  材料与方法

    1.1  主要仪器及试剂

    　　DMEMLG培养基（Gibco），优质胎牛血清（Hyclone），维拉帕米（Alexis），Trizol细胞裂解液（Sigma），胰蛋白酶及琼脂糖（Amersco），RT及PCR试剂盒（TaKaRa），钙离子探针fluo4/AM（invitrogren）、cfos、cjun、cmyc一抗（Santa  cruz），sp法二抗试剂盒（北京中衫），各引物（上海英峻基因生物公司）等；主要仪器包括参考Schaffer等［6］的方法自行建立的体外细胞牵张力学装置（其结构与原理见文献［7］）、倒置相差显微镜(OLYMPUS,日本)、流式细胞仪（BD公司，美国）、分光光度计(岛津1240紫外，日本)、PCR仪（Eppendorf，美国）等。

    1.2  细胞取材与培养

    　　MSCs取自先天性髋关节发育不良行骨盆截骨术的患者（6～9岁，征得患者及家属同意），术中髂前上棘无菌穿刺取材，Percoll淋巴分离液密度梯度法分离MSCs细胞，接种于LDMEM＋10％胎牛血清＋双抗（100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素）中，置37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱原代培养，换液传代，反复贴壁纯化，并进行增殖活性以及多向分化潜能检测［8］。

    1.3  应力及维拉帕米对细胞内Ca2+的影响

    　　取第3～6代细胞，以每孔1.5×105/2 ml的密度接种于6孔弹性硅胶膜培养板（Flexcell，USA）内培养，次日细胞贴壁，待细胞完全覆盖培养基膜后，分组干预细胞（维拉帕米在细胞受力前30 min加入，浓度为20 μmol/L［9］），如表1，力学参数为正弦波形，频率为1 Hz、强度为12％，各组细胞来源一致，不受应力刺激组除不受牵张应力刺激外，其他条件与受力组保持一致；各组实验均放置细胞培养箱里进行。各组细胞受刺激结束后，立即行细胞内钙离子的检测，用细胞外液洗涤2次，按照说明书原位加载fluo－4/AM，37℃避光孵育30 min，去除上清，细胞外液清洗细胞3次，以彻底去除细胞外残留的探针，胰酶消化离心收集细胞，制成细胞悬液，上流式细胞仪检测荧光强度，检测波长为488 nm。 表1  实验分组以及干预条件组别受力刺激时间有无加入维拉帕米预处理

    1.4  应力及维拉帕米对细胞内cfos、cjun和cmyc表达的影响

    另取细胞分4组，A（力-、V-）、B（力-、V＋）、C（力＋、V＋）、D（力＋、V-），受力组加载力学信号1 h，余参数同上。实验结束后，收集标本以行RTPCR、免疫细胞化学检测各指标mRNA以及蛋白表达。由英峻公司合成引物（表2），Trizol裂解提取各组细胞RNA，常规RTPCR，将PCR产物在琼脂糖凝胶上点样电泳，GelDocXR凝胶成像系统拍照观察并分析各条带；细胞实验结束后，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次，剪下硅胶膜，裁成小片状，0.2％triton破膜，参照试剂盒说明书，按顺序加入封闭液、一抗（1∶80稀释）、二抗，DBA显色，镜下观察，并进行细胞染色灰度值定量分析。表2  cfos、cjun、cmyc以及内参的引物设计基因

    1.5  数据统计分析

    实验所得数据均以±s表示，各参数之间的差异显著性应用统计软件SPSS 11.5进行单因素方差分析数据。

    2  结  果

    2.1  活体细胞的形态排列显微镜观察

    原代细胞接种后2～4 d开始贴壁，呈成纤维样梭形。第3～4 d首次换液后即可见细胞迅速增殖，呈克隆样生长，经多次换液及PBS洗涤后，造血细胞逐渐被清除。12～14 d细胞融合达80 ％。传代后的MSCs生长速度增快，7～10 d可铺满培养瓶底，呈细长梭形旋涡状分布直至融合细胞消化后接种于底部为硅胶膜的6孔培养板内，生长良好，培养约48 h，细胞覆盖率达80％，经周期性牵张应力或（和）维拉帕米短暂干预后，各组细胞形态未见明显差别，未见脱壁、破裂等现象。

    2.2  各组刺激对小儿MSCs游离钙离子的影响

    如图1所示，骨髓间充质干细胞受不同时间应力作用后，胞内钙离子的荧光强度不同程度的提高。细胞内钙离子浓度在受力1 min后即升高，荧光强度是对照组的164.63％，3、5 min升高更明显，荧光强度分别是对照组的200.06％、211.21％，干预10 min后钙离子浓度升高的幅度有下降趋势，荧光强度是对照组（a0组）的175.91％；若应力干预前30 min加入钙离子拮抗剂维拉帕米，部分的阻断细胞内钙离子增高，但随作用时间的延长，阻断作用逐渐变弱，其荧光强度分别是对照组（b0组）的133.62％、140.27％、146.77％、148.31％。

    2.3  RT－PCR检测cfos、cjun和cmyc基因的表达情况

    　　如图2所示：未受力组细胞，无论加与不加维拉帕米，两组的 cfos、cjun和cmyc基因均不表达或微量表达，加载1h的力学信号后，细胞内cfos、cjun和cmyc基因的表达明显增强，经维拉帕米预处理后，部分的阻断了以上作用，其三者的mRNA的表达水平分别抑制了44.29％，22.18％以及49.26％，以cfos和cmyc抑制较明显。

    图1  各组刺激后MSCs游离钙离子变化  （根据SPSS 11. 5T检验， a1～a10与a0相比以及b1～b10与b0相比，P均<0.01，有显著统计学意义；a0与b0相比，P>0.05，无统计学意义；b1与a1，b3与a3，b5与a5，b10与a10相比，P均<0.01，有显著统计学意义。）

    图2  各组干预对MSCs细胞cfos mRNA、cjun mRNA和cmyc mRNA表达的影响  A（力-、V-）、B（力-、V＋）、C（力＋、V＋）、D（力＋、V-），D组与A组比较， *P<0.01，有显著统计学意义；C组与D组比较△P<0.01，有显著统计学意义。

    2.4  免疫细胞组化检测cfos、cjun和cmyc蛋白的表达情况

    未受力组（有和无维拉帕米预处理）均为MSCs胞质和胞核染色较浅，cfos、cjun和cmyc染色相近，经1 h的应力作用后，细胞核染色较深，呈棕褐色，经维拉帕米预处理的受力组，染色处于两者之间，主要为细胞核膜边缘深染，如图3。

    图3  各组干预对MSCs细胞内cfos、cjun和cmyc蛋白表达 

    A（力-、V-）、B（力-、V＋）、C（力＋、V＋）、D（力＋、V-），D组与A组比较， *P<0.01，有显著统计学意义；C组与D组比较△P<0.01，有显著统计学意义。

    3  讨  论

    机体对力学响应的基本理论是细胞感受其微环境中的力学信号，并将信号转化为细胞内一系列的生物化学反应的过程，包括应力的感受、生物学信号的产生以及胞内信号转导、基因表达等变化［10］。不同的细胞外信号刺激有不同的信号传导通路，涉及多个中间信使。本研究发现短暂的应力刺激，即可明显增强胞内钙离子的荧光强度，在一定范围内与作用时间成依赖性，干预超过10 min后钙离子浓度升高的幅度则有下降趋势。细胞经维拉帕米预处理后，极早期（1 min），药物组的胞内钙离子浓度升高指数仍较大，之后钙离子浓度升高平缓。维拉帕米可以部分的阻断细胞内钙离子的增高，但随作用时间的延长，阻断作用逐渐变弱。由此推断，极早期细胞内钙离子浓度的升高急速，可能为应力刺激MSCs胞内钙动员刺激胞内钙库Ca2＋的释放，以及胞膜牵张敏感钙通道直接感应力学信号等促进细胞内钙离子浓度变化，而随后的钙离子浓度升高平缓可能提示钙库Ca2＋耗尽，而又被维拉帕米阻断L型Ca2＋通道，Ca2＋内流受到阻滞，而形成了钙离子升高的“平台期”。

    cfos、cjun蛋白在细胞受应力刺激合成再经磷酸化修饰后返回细胞核，共同组成AP-1转录因子，以高亲和力结合在靶基因的DNA相关序列AP-1结合，整合通路上游的信号，成为生物合成的早期标志之一。cmyc基因产物是一个与细胞增殖有关的核蛋白，它在胞浆内合成，并与另一种蛋白质如Max结合形成寡聚体，其核内定位信号使其定位并停留在核内，与特异的DNA位点结合，改变细胞生长和分化。本实验向MSCs施加1 h的牵张应力，发现cfos、cjun和cmyc表达明显增强，细胞经维拉帕米预处理后，可以部分的阻断了以上作用。Peake等［11］在细胞力学的研究中，发现cfos等早期反应基因是钙离子信号通道的下游之一，其浓度受钙离子的影响。机械刺激引起胞内Ca2+浓度升高，促使Ca2+/CaM与钙调素依赖蛋白激酶((CaMK)的CaM结合域相结合，从而活化CaMK，后者通过磷酸化活化CREB的Ser133而增强cfos的转录活性，与PKA协同参与细胞核反应。细胞膜存在多种类型的钙离子通道，如：电压操纵的钙通道（主要为L型Ca2＋通道）、受体操纵的钙通道、第二信使操纵的钙通道等。本研究使用的维拉帕米属于L型Ca2＋通道，特异性阻断受应力刺激导致膜电压变化调控钙通道开放所发生的Ca2+的内流，有效地部分阻断了应力导致细胞的早期反应基因蛋白的表达。但其中的阻断作用只能为部分阻断，其原因可能与机械应力促进细胞内钙离子浓度增高，并不是依赖于单一的钙离子通道活化，而是与多种钙离子通道的活化、胞外Ca2＋内流和胞内Ca2＋动员有关，而维拉帕米却只能阻断L型Ca2＋通道开放所引起的细胞生物学效应。Peake等［11］应用的是Ca2＋鳌合剂（EDTA）以及机械力敏感型Ca2＋通道阻断剂（Gadolinium），均也可部分抑制机械刺激所引发成骨细胞的生物学效应。

    由此，作者可以推断，外界应力刺激MSCs，启动多种钙离子通道途径，引发胞外钙内流以及（或）胞内质网释放钙离子。胞内钙离子浓度增高，介导早期反应基因（cfos、cjun、cmyc等）表达，参与调节信号传导以及促进细胞增殖分化等生物效应，但其中具体过程仍需进一步的探讨。

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作者单位：1.南方医科大学附属南方医院创伤骨科，广州 511700；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院外科,武汉 430030