他克莫司对周围神经损伤后脊髓组织中肝细胞生长因子表达的影响

【摘要】  ［目的］ 探讨他克莫司对大鼠周围神经损伤后脊髓组织中肝细胞生长因子 (HGF) 表达的影响。［方法］成年雄性大鼠 50 只，随机分为正常组、损伤组和治疗组，后两组行双侧坐骨神经切断。术后治疗组颈后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg)，损伤组注射生理盐水。术后不同时间点取 L4～6脊髓，应用 Western blotting 技术及免疫荧光标记对脊髓组织中HGF 的表达变化进行定量和定位检测。［结果］HGF 在脊髓灰质前角、中间带和后角的各类神经元中均有表达；损伤组与正常组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达之间无显著性差异 (P>0.05)，治疗组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达在术后 7、14 d 时明显高于损伤组 (P< 0.05)。［结论］ (1) 周围神经损伤本身并不能使脊髓组织中 HGF 的表达上调；(2) 他克莫司能诱导周围神经损伤后内源性 HGF 的高表达，从而保护相应神经元，促进轴突生长。

【关键词】  周围神经； 创伤与损伤； 肝细胞生长因子； 他克莫司

Effect of tacrolimus on expression of hepatocyte growth factor in rat spinal cord following peripheral nerve injury∥PAN Feng,CHEN Anmin,TAO Fenghua,et al.Department of Orthopaedics,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

    Abstract：［Objective］To explore the effect of tacrolimus on expression of hepatocyte growth factor (HGF) in rat spinal cord following peripheral nerve injury.［Method］Fifty male rats were randomly divided into normal group,injury group and treatment group.Models of peripheral nerve injury were established by transection of bilateral sciatic nerve at 0.5 cm distal to piriform muscle.Then treatment group received subcutaneous injection of tacrolimus (1 mg/kg) at the back of the neck,while injury group received 0.9 % saline.The L4～6 spinal cords were harvested at various time points after surgery.Western blotting and immunofluorescence staining were used to detect the level and position of HGF in the spinal cord.［Result］HGFpositive neurons were located in anterior horn,intermediate zone and posterior horn of gray matter in normal spinal cord.There was no significant difference in the expressions of HGF between injury group and normal group,while the expression of HGF was significantly higher in treatment group than that in injury group at 7 and 14 days after surgery.［Conclusion］Peripheral nerve injury does not upregulate the expression of HGF in spinal cord,while tacrolimus can induce high expression of endogenous HGF after injury to protect neurons and promote axonal outgrowth.

    Key words：peripheral nerves;  wounds and injuries;  hepatocyte growth factor;  tacrolimus

   周围神经损伤可引起相应脊髓节段神经元的死亡，严重影响了周围神经再生及后期功能恢复。新型免疫抑制剂他克莫司，已被证实对大鼠坐骨神经切断后的脊髓神经元具有保护作用，使其免遭凋亡［1］，但其机制有待进一步阐明。肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor，HGF) 是最新发现的一种神经营养因子，在脑和脊髓的不同区域均有表达，具有促进神经元存活、加速神经再生的作用［2］。本研究的目的在于明确诱导内源性 HGF 的表达上调是否构成周围神经损伤后他克莫司发挥神经营养和神经保护作用的因素之一。

    1   材料与方法

    1.1  动物分组与模型制备

    成年雄性健康 Wistar 大鼠 50 只 (武汉大学实验动物中心提供)，体质量 200～250 g。随机分为损伤组和治疗组，每组各 20 只，剩余 10 只设为正常组。损伤组和治疗组大鼠行双侧坐骨神经切断术：大鼠经 1 % 戊巴比妥钠 30 mg/kg 腹腔内麻醉后，取俯卧位，术区剪毛、消毒铺单，无菌条件下行臀部斜行切口，长1.5 cm，在臀肌间隙暴露坐骨神经，距梨状肌下缘 0.5 cm 处切断坐骨神经，近端以 5-0 号线双重结扎，远端切除 1 cm 后埋入股二头肌中，缝合切口。术后治疗组大鼠颈后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg)，损伤组大鼠以相同方法给予生理盐水，正常组大鼠未作任何处理。动物分笼标记，统一喂养。

    1.2  Western blotting 检测 HGF 的表达

    　　分别于术后 1、7、14 d 切取损伤组和治疗组大鼠脊髓组织，每组每个时间点随机取 5 只。大鼠经腹腔内麻醉后，暴露双侧坐骨神经，循神经根逆行追踪暴露与之相连的 L4～6节段脊髓，切取该段脊髓组织，加入裂解液冰上孵育并彻底匀浆，12 000 r/min 离心 20 min 后留取上清，考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，全湿式电转法转移到硝酸纤维素膜上，5 % 脱脂奶粉封闭 1 h 后加入兔抗鼠 HGFα 多克隆抗体 (武汉博士德生物工程公司)，内参为兔抗鼠肌动蛋白，4 ℃ 孵育过夜。TBST 溶液 (含 0.1 % Tween20 的 TBS) 洗涤 10 min × 3 次，加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔 IgG (北京中山生物公司)，37 ℃ 孵育 60 min，TBST 洗膜 10 min × 3 次，二氨基联苯胺 (DAB) 显色，结果以目的条带灰度值与同一样本肌动蛋白灰度值的比率来表示。正常组随机取 5 只大鼠于第一个时间点与其余两组一起取材检测。

    1.3   免疫荧光染色检测 HGF 的分布

    1.3.1  标本取材及准备  以 Western blotting 结果得出的 HGF 表达高峰时间确定免疫荧光染色观察时间点为术后 7 d，每组取 5 只大鼠。大鼠经腹腔内麻醉后开胸，将 11 号针头从左心室插至升主动脉，右心房开一小口。先以生理盐水 250 ml 行主动脉灌注，待流出液体变清后再以 4 % 多聚甲醛灌注 30 min。同法切取 L4～6节段脊髓，置于 4 % 多聚甲醛后固定 2 h，继而转入含 20 % 蔗糖的磷酸缓冲液 (PBS) 中 4 ℃ 冰箱内过夜，至标本沉底。－20 ℃ 恒冷箱切片机中连续横向切片，片厚 10 μm。

    1.3.2  免疫荧光染色  从各组术后 7 d 每只大鼠的冰冻切片中随机抽取，4 % 多聚甲醛 37 ℃ 固定 15 min，PBS 漂洗 5 min × 3 次，3 % 小牛血清白蛋白 (BSA) 37 ℃ 封闭 1 h，滴加兔抗鼠 HGFα 多克隆抗体 (武汉博士德生物工程公司)，以 PBS 代替一抗作阴性对照，置于湿盒内 4 ℃ 孵育过夜，PBS漂洗后，滴加异硫氰酸四甲基罗丹明 (TRITC) 标记的羊抗兔 IgG (北京中山生物公司)，37 ℃ 避光孵育 60 min 后 PBS 漂洗 5 min × 3 次，含有防淬灭剂的 50 % 甘油磷酸缓冲液封片，荧光显微镜下观察结果。

    1.4  统计学处理

    　　采用统计分析软件 SPSS 12.0 进行处理，计量资料以 ± s 表示，组间比较用单因素方差分析 (OneWay ANOVA)，P< 0.05 为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  Western blotting 分析

    HGF 在正常脊髓中有表达，其 α 链的相对分子质量约为 69 000，与理论值相一致 (图 1)。坐骨神经损伤后脊髓组织中 HGF 的表达并未随时间升高，术后 1、7、14 d 时的灰度值比值与正常组相比差异无统计学意义 (P>0.05)。应用他克莫司治疗后，相应脊髓组织中 HGF 的表达呈明显时间依赖性升高，术后 7 d 达峰值，14 d 仍有较明显表达。治疗组的灰度值比值与损伤组、正常组相比在术后 7、14 d 时差异有统计学意义 (P<0.05，P<0.01)(表 1)。表1  大鼠脊髓组织中 HGF 的表达变化

    2.2  免疫荧光染色

    在三组大鼠脊髓组织切片中均观察到免疫荧光染色阳性细胞。在脊髓前角的运动神经元内有明显的 HGF 阳性荧光染色，主要分布于神经元胞体和部分突起中，在灰质中间带和后角也可见有阳性荧光染色的神经元，荧光染色强度由弱至强不等，广泛分布于灰质Ⅲ-Ⅷ层大、中、小各类神经元的胞质及突起中。正常组大鼠脊髓组织切片显示，HGF 在正常脊髓中有恒定表达，但坐骨神经损伤后 HGF 的表达并无明显变化，其阳性染色神经元的数目及荧光强度并未增加。应用他克莫司治疗后 HGF 的表达增强，阳性染色神经元的数量多于损伤组 (图 2～4)，与 Western blotting 的检测结果相一致。图2  正常大鼠脊髓组织中 HGF 的表达 (免疫荧光染色，×200)  图3  术后 7 d，损伤组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达 (免疫荧光染色，×200)  图4  术后 7 d，治疗组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达 (免疫荧光染色，×200)

    3  讨  论

    周围神经损伤后的成功再生涉及一系列复杂的病理生理过程，其中 Fansa 等［3］将损伤神经元胞体的存活列为首要因素。而神经元作为一个整体，胞体与轴突之间的联系是十分密切的，轴突损伤实质上是一种细胞损伤，必然会累及相应的神经元胞体，而神经元的功能状态也必将会影响轴突的再生及功能的恢复。因此，周围神经损伤后再生治疗重点已经从局部外科修复，发展到采用多因子、多因素防止神经元胞体、神经纤维、效应器的变性，来保护损伤神经元，促进神经再生。临床广泛应用的免疫抑制剂他克莫司已被证实具有神经营养和神经保护作用［4］。在大鼠坐骨神经切断缝合术后局部应用他克莫司缓释膜片可保护脊髓神经元免遭凋亡［1］。亦有文献报道，他克莫司在体外可促进背根神经节神经元轴突的延伸［5］。目前关于此种神经保护药物用于周围神经损伤修复的研究中，往往关注的是其在实验模型中的治疗效果，而他克莫司若要真正应用于临床，尚需要从分子生物学的角度阐明其作用机制，而明确诱导内源性 HGF 的表达上调是否构成周围神经损伤后他克莫司发挥神经保护作用的因素之一则正是本研究意义所在。

    　　HGF是由6.845万u 的 α 链和3.373万u 的 β 链组成的异二聚体蛋白，最初被鉴定为一种强大的原代肝细胞的丝裂原，现证实也是一种新的神经营养因子，通过自分泌、旁分泌及经典的轴突运输方式与特异性酪氨酸激酶受体 cMet 结合发挥其活性，在体内和体外对中枢及周围神经系统的多种神经元具有神经营养作用［6］。研究发现 HGF 参与大脑皮质神经元的发育过程，促进轴突生长及神经元存活［2］。在正常生理条件下，HGFcMet 自分泌和/或旁分泌机制为脊髓运动神经元提供局部直接的营养支持［7］。本实验 Western blotting 分析证实，正常脊髓中存在 HGF 的恒定表达，免疫荧光染色则显示 HGF 主要分布于灰质 Ⅲ-Ⅷ层神经元的胞质及突起中，与国外学者［8］的报道相符，说明脊髓前角、灰质中间带及后角神经元在生理状态下均合成 HGF，其营养作用对于维持神经元自身存活及行使正常生理功能是必需的。

    尽管研究表明在中枢神经系统损伤［2］或缺血［9］等病理状态下，HGF 在损伤周围区域表达上调，在脊髓损伤后再生和脑组织缺血后修复过程中起着关键性作用。但本实验数据显示，损伤组术后各时间点 HGF 的表达与正常组相比差异无统计学意义，即坐骨神经损伤后脊髓组织中 HGF 的合成并未增加。这一结果与 Hashimoto 等［8］的报道一致。他们的研究显示在脊髓和背根神经节均检测到 HGF mRNA，而坐骨神经结扎并未改变其表达，与作者的实验结果相互印证，除说明周围神经损伤对中枢神经元 HGF 表达的影响不同于中枢神经系统本身的损伤外，也提示：对周围神经的伤害性刺激不足以启动内源性 HGFcMet 系统来挽救损伤神经元和防止轴突变性，而是需要通过其他途径来上调周围神经损伤后 HGF 的表达。

    鉴于神经损伤后内源性 HGF 的表达匮乏，人们致力于将重组 HGF 蛋白或病毒载体 HGF 基因转移入中枢神经系统，期望外源性 HGF 能对受损神经元起到神经营养作用。如 Hayashi 等［6］在成年大鼠脊神经根撕脱伤后应用重组腺病毒载体编码的 hHGF 基因转移防止运动神经元的死亡。但上述方法由于重组蛋白的半衰期较短及血神经屏障的存在，实际治疗效果并不尽人意；病毒载体基因转移具有潜在的危险性，如产生免疫应答，与病毒感染相关的各种毒副作用等都限制了其广泛应用，因此寻找新的以促进内源性 HGF 合成为靶点的治疗策略成为研究热点。本研究治疗组的结果显示，神经损伤后皮下注射他克莫司可上调脊髓组织中 HGF 的表达，伤后7 d 达高峰，持续至伤后 14 d 仍较损伤组有明显升高，表明他克莫司可有效诱导内源性 HGF 的高表达，这可能是周围神经损伤后他克莫司发挥神经营养和神经保护作用的因素之一。在此，他克莫司充当了促进 HGF 合成的启动因子，而上调的 HGF 又可通过自身正反馈机制促进损伤部位 HGF 的合成，与特异性受体结合发挥神经营养作用，从而保护相应神经元，诱导近侧残端或中枢神经元轴突再生，重建神经环路；同时 HGF 也是一种高效的血管生成因子，通过轴突运输到达损伤部位，介导内皮细胞增殖、分化，促进微血管形成［10］，为再生过程提供良好的微循环，这对神经再生有着重要的意义。

    本研究揭示了坐骨神经损伤后内源性 HGF 在脊髓组织中的表达、分布及时间变化规律，并从中枢神经元的角度阐明了他克莫司通过 HGF 促进周围神经再生的机制，为临床应用他克莫司治疗周围神经损伤进一步的提供了理论依据。

【参考文献】
  ［1］ 张家俊,张振伟,廖坚文,等.局部应用FK506缓释膜片对大鼠坐骨神经缝合术后脊髓神经元的影响［J］.中华手外科杂志,2005,21: 177-178.

［2］ Shimamura M,Sato N,Sata M,et al.Expression of hepatocyte growth factor and cMet after spinal cord injury in rats［J］.Brain Res,2007,1151: 188-194.

［3］ Fansa H,Keilhoff G.Factors influencing nerve regeneration［J］.Handchir Mikrochir Plast Chir,2003,35: 72-82.

［4］ 潘 峰,祝成亮,陈安民,等.脊髓损伤后低剂量 FK506 对伤段组织电解质水含量失衡的早期保护作用［J］.中国矫形外科杂志,2007,15: 1415-1417.

［5］ Keswani SC,Rosenberg B,Hoke A.The use of GAP43 mRNA quantification in high throughput screening of putative neuroprotective agents in dorsal root ganglion cultures［J］.J Neurosci Methods,2004,136: 193-195.

［6］ Hayashi Y,Kawazoe Y,Sakamoto T,et al.Adenoviral gene transfer of hepatocyte growth factor prevents death of injured adult motoneurons after peripheral nerve avulsion［J］.Brain Res,2006,1111: 187-195.

［7］ Kato S,Funakoshi H,Nakamura T,et al.Expression of hepatocyte growth factor and cMet in the anterior horn cells of the spinal cord in the patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS): immunohistochemical studies on sporadic ALS and familial ALS with superoxide dismutase 1 gene mutation［J］.Acta Neuropathol (Berl),2003,106: 112-120.

［8］ Hashimoto N,Yamanaka H,Fukuoka T,et al.Expression of HGF and cMet in the peripheral nervous system of adult rats following sciatic nerve injury［J］.Neuroreport,2001,12: 1403-1407.

［9］ Nagayama T,Nagayama M,Kohara S,et al.Postischemic delayed expression of hepatocyte growth factor and cMet in mouse brain following focal cerebral ischemia［J］.Brain Res,2004,999: 155-166.

［10］Shimamura M,Sato N,Waguri S,et al.Gene transfer of hepatocyte growth factor gene improves learning and memory in the chronic stage of cerebral infarction［J］.Hypertension,2006,47: 742-751.

作者单位：1a.武汉大学人民医院骨科,武汉 430060；1b.生命科学学院病毒学国家重点实验室,武汉 430072；1a.武汉大学人民医院骨科,武汉 430060；1b.生命科学学院病毒学国家重点实验室,武汉 430072；2.华中科技大学附属同济医院骨科,武汉 430030；3.第二军医大学附属长海医院骨科,上海 200433