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【摘要】 ［目的］改进软骨源性微载体的制备方法。对其微观结构特征及其与骨髓间充质细胞的生物相容性进行观察，探索新的可注射性组织工程软骨的制备方法。［方法］将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎，梯度离心后制备成150～300 μm的颗粒，去细胞处理后采用常规组织学方法观察软骨微粒的空间结构及化学组成，采用扫描电镜观察软骨源性微载体的形态特征，随后体外获取扩增骨髓间充质细胞，与软骨微粒复合，然后采用旋转式生物反应器扩增，构建可注射性组织工程软骨细胞。［结果］本研究制备的软骨微粒呈圆形或椭圆形，表面呈毛刷状结构，主要成分是Ⅱ型胶原和GAG，而毛刷的主要成份Ⅱ型胶原、骨髓间充质干细胞不仅与微载体结合良好，还能够在其表面大量扩增。［结论］与传统的微载体不同，软骨源性微载体与细胞复合后，不需要再将细胞消化，避免了软骨细胞外基质的损失，可以作为可注射性组织工程软骨的理想材料和方法。
【关键词】 微载体； 软骨； 骺损伤； 组织工程
Micromechanism and biocompatibility of cartilage derived microcarrier for injectable tissue engineering cartilage∥LU Qiang,ZHANG Li,PENG Jiang,et al.Orthopaedic Department of PLA General Hospital,Beijing 100853,China
Abstract: ［Objective］To improve the preparative method of catilage derived microcarrier and evaluate the micromechanism and biocompatibility of this metarial for injectable tissue engineering cartilage. ［Methods］Fresh porcine articular cartilage were obtained and shattered in the iso-osmia liquid in 4℃. After gradient centrifugation, 150-300 μm size cartilage micelles were gathered and were subjected to 1% Triton X- 100 once and physiological saline twicely. The structure of specimens were observed and assessed by inverted phase contrast microscopy,environmental scanning electron microscope.And the composition of these specimens were stained with haematoxylin-eosin, safranin-O, toluidine blue and immunohistochemistry of collagen type Ⅱ.The microcarriers were seeded with rabbit bone mesenchymal stem cells (BMSCs) and cocultured with Rotary Cell Culture System (Rotary Cell Culture System, RCCS TM).［Results］The cartilage particles had fiocculus apparence.There were numerous villus on the surface of these cartilage micelles, which were stained positive with the immunohistochemistry of collagen type Ⅱ.The inner part of these cartilage micelles were stained positively with safranin-O and toluidine blue. After coated with BMSCs and cultured in the RCCSTM, the cells grew well on the surface of the cartilage micelles and the latter could be disperse again after blowed with pipette.［Conclusion］The cartilage micelles, which have large surface area and good boicompatibility,is a new kind of microcarrier for injectable tissue engineering cartilage.
Key words：microcarrier； cartilage； epiphysis injury； injectable
儿童骺板损伤是小儿骨科常见的一种难治性疾病。儿童骺板损伤后，往往会造成骺板早闭，骨桥形成，进而并发肢体畸形和功能障碍，影响儿童的生长和发育。对于儿童骺板损伤的治疗，最常见的方法是将骨桥切除，采用脂肪或其它填充物填充［1］。近年来，填充方法不断扩展，采用组织工程的方法填充组织工程骺软骨可能是一种有前途的方法。本研究采用软骨源性微粒，结合微重力生物反应器技术，体外扩增细胞，制备出一种可注射性的组织工程骺软骨，现报道如下。
1 实验材料和方法
1.1 软骨源性微载体的制备
对文献中的微载体的制备方法进行改进［2、3］：无菌条件下取正常新鲜猪膝、髋关节软骨，将关节软骨浸泡于4℃下PBS缓冲液(pH 7.5)，缓冲液含0.035%(w／v)的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和0.1%(w／v)的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)。液态条件下用粉碎机粉碎，采用AllegraX-22R型离心机(F0850转头，Beclonan公司，美国)梯度离心，获取直径100～300 μm软骨微粒。4℃下加入含1%Triton X-100(北京化学试剂公司) 的10 mmol／L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，缓冲液中PMSF含量同上。持续振荡24～72 h，去除细胞成分。以1 000 r／min离心5 min后PBS冲洗。37℃下加入50 U／mLDNA酶(Sigma公司，美国)和1 U／mLRNA酶(Sigma公司，美国)消化12～48 h。同上法离心后三蒸水冲洗后，静置。收集沉淀并封装。25 kGy60CO照射24 h消毒灭菌。-20℃保存备用。
1.2 骨髓基质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)分离、培养与扩增
根据参考文献方法［4］分离培养骨髓基质干细胞。选择髂后上棘为穿刺点。16号骨髓穿刺针用肝素钠稀释液预湿后刺入皮下，确定在髂后上棘的进针点，轻度斜向尾侧进针3～4 mm深，检查穿刺针固定于髂骨上。取出针芯，连接10 ml注射器，内含肝素钠稀释液1.0 ml(肝素钠3 000 u)，抽取骨髓液5～6 ml。按1∶1体积比将抽取的骨髓沿管壁缓慢滴加底部装有Percoll(比重1.073 g／ml)分离液的离心管中，2 000 r/min离心20 min。用吸管收集中间的单个核细胞层(雾状白膜层)，Hank’s液洗涤2次。收集细胞沉淀，用含10%FBS的DMEM培养液5×106／ml混匀后接种于培养瓶中，置于37℃，5%CO2孵箱中培养。4 d后首次换液。此后每周换液2次，筛除未贴壁生长的细胞。倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)下观察原代细胞汇合达80%～90%时，即可进行传代。在P3代以前使用。
BMSCs与软骨源性为载体的复合与扩增：采用1 ml注射器将P3代的BMSCs按2×104／mL密度与软骨微粒复合，于37℃、5%CO2孵箱内孵育1 h，随后将BMSCs与软骨微粒复合体置于三维微重力旋转式细胞生物反应器(rotary cell culture system，RCCSTM，美国)进行培养，3 d后吸取培养液在倒置显微镜下观察细胞在软骨微粒上的黏附与生长情况。
1.3 观察指标
1.3.1 组织化学染色观察
甲苯胺蓝染色、番红O染色：将制备的软骨微粒悬液涂于载玻片上，10%中性福尔马林固定12 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，进行甲苯胺蓝染色、番红O染色，光镜下观察。
免疫组织化学染色：将制备好的软骨微粒涂片4%的多聚甲醛固定液固定，漂洗后晾干，脱蜡至水，3%H2O2／甲醇室温孵育10 min，漂洗后封闭。滴加鼠抗人Ⅱ型胶原(1∶100)、4℃过夜。再次漂洗。加入生物素标记二抗工作液孵育30 min。滴加辣根酶标记链卵白素。DAB／H2O2显色，苏木素复染，树脂封片。显微镜观察。
1.3.2 支架材料的微观结构
显微镜观察：将软骨源性微粒悬液涂片置于显微镜下观察微粒的形态和表面结构特点。
扫描电镜观察：将软骨源性微粒悬液涂片，2.5%戊二醛4℃固定24 h，pH7.4的PBS冲洗，1%锇酸4℃固定4 h，梯度乙醇脱水，CO2干燥器干燥、喷金、黏托，扫描电镜观察。
2 结果
2.1 软骨源性微载体的结构和组成
显微镜下见软骨源性微载体呈现为心形、椭圆形或圆形绒球状(图1、2)，软骨微粒大小150～300 μm，表面绒毛密集覆盖，绒毛长度接近甚至大于软骨微粒本身的直径，微绒毛的靠近软骨微粒的部分甲苯胺蓝染色(图4)和番红“O”染色(图3)强度较周边部明显，而Ⅱ型胶原的染色却是周边部明显(图6)。对于软骨微粒本身以上三种染色都是强阳性。
环境扫描电子显微镜下观察，见软骨表面覆盖大量微绒毛，微绒毛呈束状离心排列，基底部与软骨微粒的体部紧密相连，微绒毛直径45～130 nm之间(图5)，呈丝状，表面有浆状物质包裹。
2.2 软骨源性微载体的生物相容性观察
支架与BMSCs复合后，在RCCSTM中培养72 h后的外形保持良好，软骨微粒绒球状外观消失，表面微绒毛消失，替代以大量细胞覆盖(图7)。在生物反应器内培养72 h后，虽然表面上软骨块之间有聚集，但是采用吸管轻轻吹打，就可将其均匀分散。另外，在取样过程中，采用常规的16号注射器针头，很容易将其带有细胞的微载体抽出。
3 讨论
儿童骺软骨损伤是小儿骨科临床上常见的一种难治性损伤。骨骺损伤的类型(Salter-Harris分型1963年)包括：Ⅰ型骨折线通过骺板软骨成熟区细胞退化层，如全骺分离，Ⅱ型骨折线通过骺板软骨成熟区细胞退化层，到达骺板边缘前折向干骺端，Ⅲ型骨折线从关节面开始，通过骨骺进入骺板软骨成熟区细胞退化层，然后90°转弯沿软骨成熟区细胞退化层直达骺板边缘，Ⅳ型骨折线从关节面开始，经骨骺、骺板全层和干骺端3部分，V型垂直挤压暴力引起的骺板软骨压缩骨折，Ⅵ型为骺板软骨膜环(Ranvier软骨膜沟)损伤。
无论是哪一种损伤都有可能造成骨桥形成，骺板早闭，最终导致肢体畸形和功能障碍，影响儿童骨骼发育。目前采用的最常见的治疗方案为骨桥切除，填充以有活性的组织，如自体脂肪、肌肉、肌腱、软骨、骺板，或无活性的填充物，如明胶海绵、骨水泥、医用胶等［5］。这些材料或由于取材困难，或由于不能有效阻止骨桥形成而存在这样或那样的缺点。组织工程技术的兴起，给骺损伤的治疗带来了希望，采用自体骺软骨细胞或干细胞移植构建具有再生活性并能阻止骨桥形成的组织工程骺软骨成为治疗儿童骺损伤的新的发展方向。但是对于组织工程骺软骨构建来讲，需要解决两个重要问题：一是快速有效地获取种子细胞或将干细胞诱导成为骺软骨细胞；另外一个方面就是采用何种载体承载这些已经扩增了的软骨细胞。关于组织工程骺软骨的构建，已经有文献报道。Kato YL［9］采用兔肋骨生长板软骨细胞构建软骨组织。骺板软骨细胞借助生物凝胶和高孔隙率的三维支架材料(CPPF／PLLA)复合，经体外培养形成典型的软骨，其组织结构和天然骺板软骨类似，具有一定的力学强度，始终保持了初始外形［7］。 图1普通光学显微镜下软骨源性微载体的外形呈绒毛状。标尺长度：200 μm
图2相差显微镜下软骨源性微载体的外形 软骨更清晰，尺寸100～300 μm。标尺长度：200 μm 图3“O”染色软骨源性微载体呈球形、椭圆形和心形外观，微绒毛番红“O”染色呈弱阳性，但在近软骨微粒的进中心区域呈强阳性。标尺长度 图3a400 μm 图3b200 μm 图4苯胺蓝染色 软骨源性微载体甲苯胺蓝染色阳性，但在近软骨微粒的进中心区域呈强阳性。周围细丝结构明显，与软骨微粒紧密相连。标尺长度：左图400 μm，右图200 μm 图5a软骨源性微载体的扫描电镜观察 软骨微粒绒毛状外观
图5b 微绒毛与软骨微粒紧密相连，离心放散排列，微绒毛直径45～200 nm之间，表面有浆状物质覆盖。 图6Ⅱ型胶原免疫组化染色 软骨微粒绒毛状染色阳性。标尺长度：200 μm 图7软骨源性微载体复合BMSCs在RCCSTM中培养72 h后的外形 软骨微粒绒毛状外观消失，大量细胞覆盖表面。标尺长度：200 μm 但是，随着微创技术的开展，有没有可能构建出一种可注射性的组织工程骺软骨?本研究依此展开设想：采用关节软骨微粒构建软骨源性微载体，采用微重力旋转式细胞生物反应器大量扩增种子细胞，探讨这种微载体构建可注射性组织工程骺软骨的可能性。相关的研究表明［8］：用Cytodex-3微载体培养软骨细胞，软骨细胞倍增的时间较单层培养明显缩短，采用微载体培养技术能够促进软骨细胞的增殖。还有研究［9、10］观察到应用微载体培养不仅支持细胞生长，还有利于维持软骨细胞的表型，并能使已经去分化的软骨细胞在分化。作者的研究结果表明，软骨源性微载体在液体中粉碎以后，采用梯度离心的方法获得150～300 μm的颗粒，获得微粒近似圆形，表面呈微绒毛结构，与传统的微载体相比，本研究制备的微载体具有以下几方面的优越性：①更大的表面积，更有利于细胞的粘附、生长和扩增；②细胞扩增完毕后，不需要酶消化，单独获取细胞，造成细胞外基质和细胞数目的丧失，有利于细胞活性的维持；③本研究制备的微载体，富含GAG和Ⅱ型胶原，与天然软骨的成分一致，可能有利于软骨细胞表型的维持，防止其去分化，或有利于去分化的软骨细胞再分化。
与本研究小组前一阶段制备微载体的方法相比，本研究在微载体的制备方法方面进行了改进。即在4℃条件下于液体环境中将软骨粉碎，避免了在粉碎过程中因为局部高温导致的软骨成分的变性和活性的丧失。同时避免了因为冷冻干燥而带来的操作步骤繁琐和不便，更有利加工流程中的质量控制。
存在的缺点与不足：本研究采用软骨源性微载体扩增细胞，虽然这种微载体具有良好的生物相容性，但是细胞在其表面的生长情况的观察需要进一步研究，尤其是细胞在这种具有微绒毛表面的微载体上的生长情况的观察方面，还需要进行进一步的研究；另一方面，本研究只是采用微载体扩增了细胞，其构建可注射性组织工程软骨的有效性还需要进行进一步的验证。这也正是本研究正在进行的工作。
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作者单位：解放军总医院骨科，北京 100853