绿茶多酚保存同种异体神经移植体的实验研究

【摘要】  ［目的］研究绿茶多酚溶液保存的同种异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果。［方法］ 48只成年雄性Wista大鼠，随机分为4组，每组12只，将坐骨神经在梨状肌孔下5 mm 处切除1.0 cm, 神经缺损分别用4种移植物桥接。A组：自体神经移植；B组：新鲜异体神经移植；C组：经冷冻处理的异体神经移植； D组：用绿茶多酚保存的异体神经移植。术后6、12周通过大体观察、电生理学检查、组织学观察、透射电镜观察、图像分析与定量学检测评价各组修复神经缺损的效果。［结果］A、D组间差异无统计学意义（P＞0.05），Ａ组、Ｄ组的各项指标均优于B组、C组（P＜0.0５或P＜0.01）。［结论］绿茶多酚溶液保存的同种异体神经是良好的神经移植替代材料。

【关键词】  同种异体移植； 绿茶多酚； 神经再生

Experimental study on nerve allografts stored in green tea polyphenol solution∥KONG Fanbin, GE Baofeng，LIU Xingyan, et al.The Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

    Abstract：［Objective］To explore the outcome of repairing nerve defects with nerve allografts stored in green tea polyphenol solution.［Method］Fortheight male mice were randomly divided into 4 groups of nerve grafting,with 12 rats in each group.A 1.0 cm sciatic nerve segment, 5 mm away from infrapiriform foramen, was removed and repaired by 4 kinds of nerve allografts.Group A：autografts.Group B：allografts. Group C：cryopreserved nerve allografts.Group D：nerve allografts stored in green tea polyphenol solution.At  6 weeks and 12 weeks,a series of examinations were performed,including the gross appearance,electrophysiological test,histological observation,electron microscopic study and quantitative analysis with image analysis system.  ［Result］All the parameters of groups A and D were better than those in groups B and C(P<0.05 or P<0.01）.There were no statiscally significant differences between groups A and D.  ［Conclusion］The nerve allograft stored in green tea polyphenol solution is a good substitute for nerve graft.

    Key words：allograft；  green tea polyphenols；  nerve regeneration

    周围神经缺损，无论在平时或战时，都十分常见。缺损后，临床上首选自体神经移植，但自体神经来源有限，并给供区造成一定的功能障碍。目前，解决神经缺损的研究主要集中在两个方面。一方面是研究采用肌桥、静脉管、硅胶管、组织工程等替代物，前三种的结果都不如人意，而后者尚处于实验阶段。另一方面是研究同种异体神经移植，它不但具有其它替代材料所没有的网管状神经内部结构，利于神经的再生，而且来源广泛，可以得到与缺损神经长短相似的移植物，但存在免疫排斥问题。近年来，Ikeguchi等［1］ 报道采用绿茶多酚（green tea polyphenols，GTPs）溶液保存的异体神经能降低移植神经的缺血性损伤和移植后的免疫反应，为异体神经移植提供了一条新的、很有应用前景的保存途径。但目前国内尚未见有关GTPs处理异体神经移植体的报道。本组研究GTPs溶液保存的同种异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果，为临床更合理、更有效地应用异体神经移植提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及材料

    　 近交系Wistar雄性大鼠66只，体重200～220 g，由兰州大学动物实验中心提供（合格证号：SCXK甘20050007）。GTPs（浙江东方茶业科技有限公司， GTPs纯度﹥98%,批号：20071210）。DMEM（Sigma公司）。

    1.2  实验分组

    66只Wistar大鼠，18只用于神经移植体的制备，48只作为实验对象。将实验动物随机分为4组，每组12只。(1)自体对照组（A组）：用自体对侧切除的1.0 cm坐骨神经修剪后立即移植；(2)异体对照组（B组）：将坐骨神经取下修剪后，立即同种异体移植；(3) 冷冻处理组（C组）：异体神经经冷冻处理后移植；(4)GTPs处理组（D组）：异体神经经GTPs溶液处理后移植。

    1.3  处理神经的制备

    18只Wistar大鼠取其双侧坐骨神经，剥离神经表面结缔组织，得到36条供移植的神经，分别移植于Ｂ、Ｃ、D组。(1)冷冻处理神经的制备：修剪后的神经，立即置入盛有15％二甲基亚砜的密闭容器中封存，4℃冰箱中保存30 min后，移入超低温冰箱，以0.5～1.0℃/min降温，降温至-60℃维持30～60 min后，置入-196℃液氮中保存1个月，37℃复温30 min后移植［2］;(2) GTPs处理神经的制备：修剪后的神经，立即置入盛有GTPs (1 mg/ml)的DMEM溶液中，在4℃冰箱中保存7 d，转入不含GTPs的DMEM溶液中4℃保存23 d，然后进行神经移植［1］。

    1.2  手术方法

    将大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30～40 mg/kg）后，以俯卧位固定于手术板上。以8%硫化钠溶液将鼠股后外侧区毛脱净，用5%碘伏消毒，铺无菌洞巾。于鼠股后外侧区行弧形切口，以眼科剪剪开皮肤及皮下组织。在手术显微镜下，自股二头肌与半腱肌、半膜肌肌间隙剪开结缔组织，钝性分离股二头肌与半腱肌，以缝吊法牵开臀大肌充分显露坐骨神经。从梨状肌孔下0.5 cm处，用消毒剃刀片整齐切断并切除神经干1.0 cm。将供移植的神经修剪至1.0 cm后移植，植入神经与宿主神经等粗。用11-0无损伤缝合线行端对端神经外膜缝合，力求针距、边距均匀，对合整齐，无扭转，无张力，每一断端缝6～8针。然后消毒，彻底止血后，逐层关闭切口。所有操作均由1人完成。大鼠的麻醉、术前和术后的喂养、室温及管理条件完全一致。术后分笼饲养，不使用任何药物。

    1.3  检测指标及方法

    1.3.1  一般情况观察  术后密切观察大鼠的精神状态、饮食、活动、伤口愈合、足底溃疡等情况。

    1.3.2  电生理学检查  所有大鼠分别于术后6、12周每组各取6只，用丹麦产Keypoint肌电图诱发电位仪进行电生理测定，频率为1次/s，强度6 mA，测定运动神经传导速度。显露坐骨神经后，两刺激电极置于移植神经近端及腓总神经横越腓骨肌处，距离为2.0 cm。记录电极斜行45°插入胫前肌肌腹中部。

    1.3.3  大体观察  取材时进一步观察移植体的粗细、质地、颜色、与周围组织粘连、表面血管分布等情况。

    1.3.4  组织学观察  术后6、12周各组取6只大鼠将移植体连同与之相连的远近端宿主坐骨神经各5 mm以及远端入肌点神经一并取下，分别作HE染色、Masson三色染色、组织块银浸染色［3］。光镜下观察再生神经的形态结构。

    1.3.5  透射电镜观察  术后12周各组移植体中段经3%戊二醛固定，1%饿酸后固定，梯度乙醇脱水，618#环氧树脂包埋，超薄切片（片厚不超过0.1 μm），醋酸铀及枸橼酸铅染色，JEM-1230透射电镜观察再生神经的轴突、髓鞘的超微结构。

    1.3.6  图像分析与定量学检测  术后12周，用CM-2000医学生物图像分析系统对神经移植体远近端的横切面银染色切片进行轴突计数处理。

    1.4  统计学方法

    采用SPSS 11.5统计软件进行处理，数据用均数±标准差表示，进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  一般情况观察

    术后4周左右，各组均有不同程度的足踝部肿胀、溃疡，步态不稳，患肢走路拖行。A、D组在7周左右溃疡逐渐愈合，瘢痕不明显；B组在12周左右才基本愈合，并出现部分足趾缺损畸形；C组在9周左右溃疡逐渐愈合，有明显瘢痕。

    2.2  电生理学检查

    术后6周、12周，各组大鼠行神经电生理检测运动神经传导速度结果显示：Ａ、Ｄ组优于B、C组，差异有统计学意义（P<0.01）；A、D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；B、C组比较，差异有统计学意义（P<0.05）(表1)。表1  各组神经移植术后6、12周神经传导速度

    2.3  大体观察

    肉眼见新鲜大鼠坐骨神经有一定的柔软度和韧性。经冷冻处理的神经（C组）复温后色泽较正常神经稍白，柔软度和韧性接近正常神经。经GTPs溶液处理的神经（D组）色泽为茶黄色，较正常神经稍硬、韧性大，更利于手术缝合；术后6周色泽转为淡黄色，12周见色泽接近正常神经。术后6周，各组神经移植体均水肿，与周围软组织有粘连，不易分离，A、D组较轻，B、C组较重。12周时 A、D组移植神经形态较饱满，与宿主坐骨神经粗细较一致，可见类似正常神经的横纹结构；B组神经已萎缩变细，与周围组织广泛粘连；C组移植神经段较宿主坐骨神经稍细，表面可见纵行走向的毛细血管。

    2.4  组织学观察

    　　GTPs溶液保存的神经移植体结构清晰（图1、2）。术后6周，A组与Ｄ组形态学变化相似，仅神经外膜周围有少量炎性细胞浸润，较多新生轴突已长入移植体，排列整齐，神经纤维轻度肿胀，可见较多新生血管在移植神经中形成，有较多的雪旺氏细胞（Schwann cell，SC)增生。B组可见移植物中髓鞘脱水，有大量的空泡变性，大量纤维组织增生，再生神经纤维较少，且神经排列紊乱。C组神经移植物中神经纤维肿大，轴突间水肿明显，脱髓鞘改变，有少量的新生血管形成，主要集中在外周，再生神经纤维较B组多（图3）。

    　　术后12周，A、D组再生轴突已通过移植体，有较多髓鞘形成，SC再生明显，排列规则，分布均匀；B组有大量结缔组织增生，再生神经纤维较少，绝大多数再生的轴突未通过整个移植段；C组再生轴突数量较多，束间有较多结缔组织增生，少部分再生的轴突通过整个移植段（图4）。

    2.5  透射电镜观察

    A、D组较相似，可见有髓神经纤维及无髓神经纤维再生明显，排列规则，轴突较粗，再生轴芽被SC包绕，轴浆内富含微丝、微管等结构，髓鞘壁厚，板层致密。B组再生神经纤维数量较少，发育最差，髓鞘SC基膜与轴突分离，髓鞘肿胀，厚薄不均，有的皱褶分离，髓鞘板层松散，有的溶解消失呈空泡状。C组有部分神经纤维再生，髓鞘壁较薄，再生轴突发育较A、D组差（图5,6）。

    2.6  图像分析与定量学检测

    各组近端轴突数目无统计学意义（P>0.05），但远端Ａ、Ｄ组优于B组、C组，差异有统计学意义（P<0.01）；A、D组比较， 差异无统计学意义（P>0.05）；B、C组比较，差异有统计学意义（P<0.05）(表2)。表2  术后12周各组神经有髓神经纤维数

    3  讨  论

    绿茶具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗辐射损伤、抗炎、降血糖等作用，其主要成分是GTPs。近年来有学者提出用GTPs做神经保存液有较大的前景。Ikeguchi等［1］将雄性的DA鼠神经置于含GTPs (1 mg/ml)的DMEM溶液中，4℃保存1周，然后转入不含GTPs的DMEM溶液中4℃保存3周，最后移植到雌性的Lewis鼠上。其效果与自体神经接近。而冷冻处理法是较为传统的一种处理方法。王秋根等［4］将大鼠的供体神经按不同温度（-196℃、-80℃、-40℃)进行冷冻，进行同种异体移植后发现，神经断端再生轴突能通过并长入远断端，并认为冷冻温度以-196℃为好。但大多数学者认为冷冻处理法不能清除细胞崩解产物，组织相容性抗原复合物仍然存在，移植效果比自体移植效果差。

    本实验分别进行了自体神经移植、新鲜异体神经移植、经冷冻处理的异体神经移植和GTPs保存的异体神经移植，并对移植后效果进行了比较。用GTPs溶液保存的神经移植体，经HE染色后观察发现，用GTPs溶液保存1个月的神经仍然保留了有利于SC的迁移生长的神经膜管结构。本组在移植前，对GTPs溶液保存的神经移植体与冷冻保存的移植体进行了比较， HE染色后光镜下观察GTPs保存法保存了完整的供神经再生的基膜管，且色彩相对较鲜亮，而冷冻保存法光镜下见细胞暗淡，可能是由于GTPs溶液保存的移植体的SC仍有少数存活。

    术后6、12周，电生理学检测运动神经传导速度结果发现，Ａ、Ｄ组优于B、C组。A、D组差异无统计学意义。组织学观察发现，Ｄ组有髓神经纤维数目、SC增生数目、炎性细胞浸润程度、血管化程度均较B、C组好。电镜观察发现，D组神经纤维呈束状分布，有髓神经纤维数目较多，髓鞘的板层结构清晰，SC发育良好，包浆中可见多种细胞器，其神经再生效果明显好于B、C组。术后12周发现A、D组有髓神经纤维数明显好于B、C组。

    综上所述，GTPs保存的同种异体神经移植后效果好于冷冻处理组及新鲜异体处理组，与自体神经移植组接近。本组认为其可能机制是: 基底膜和SC是神经再生的两大基本要素。GTPs溶液保存的同种异体神经能较好地保留促进周围神经再生并有导向作用的神经膜管结构。而供体的SC虽具有抗原性，但能分泌多种活性物质促进神经再生。经GTPs处理后，供体的SC仍有少数存活；轴索在供体的SC的帮助下可以成功长入远端。Ikeguchi通过实验发现离体神经不仅能成功地在GTPs溶液中保存1个月，而且GTPs还能降低移植神经的缺血性损伤和移植后的免疫反应。Ｌee等［5］也认为GTPs能减少缺血性模型中神经元的缺血性损伤。Nie等［6］认为GTPs还具有神经保护作用。

    国内外有关异体神经移植体保存方法的研究较多，除传统的冷冻、辐照、乙醇溶液、甘油溶液等保存方法外，还出现了化学去细胞法、GTPs溶液等近几年出现的保存方法。其中化学去细胞法进展较快，衷鸿宾等［7］应用Triton X-100和脱氧胆酸钠溶液对犬异体神经进行去细胞处理，建立了大型哺乳动物(犬)的粗大和长段去细胞神经的化学萃取方法。许文静等［8］应用化学去细胞同种异体神经移植治疗完全断裂周围神经损伤患者，获得了较好的临床效果。但很多学者认为经化学去细胞后神经移植体为无细胞、髓鞘及其碎片的空的神经基膜管，缺乏了供体的SC分泌多种活性物质促进神经再生作用。而经GTPs溶液保存后供体的SC仍有少数存活，可以分泌活性物质促进神经再生，且GTPs还具有降低移植神经的缺血性损伤等作用，故GTPs溶液保存法应有很好的临床应用前景。但GTPs溶液保存神经的最佳浓度、最佳保存时间以及其作用机制尚需进一步研究。

    图1  GTPs溶液保存1个月的神经，HE染色，×100倍  图2  GTPs溶液保存1个月的神经，移植前神经纤维结构清晰，HE染色，×400倍  图3  术后6周组织学观察, 神经移植体中段，马森染色， ×400  图3a  A组有较多新生轴突已长入移植体，排列整齐，神经纤维肿胀不明显  图3b  B组大量的空泡变性，大量纤维组织增生，再生神经纤维较少，且神经排列紊乱  图3c  C组神经移植物中神经纤维肿大，轴突间水肿明显，脱髓鞘改变，有少量的新生轴突；图3d   D组有较多的新生轴突，神经纤维肿胀不明显。图4  移植术后12周组织学观察，神经移植体中段，银染色，×400倍  图4a  A组有大量髓鞘形成，SC再生明显，排列规则，分布均匀  图4b  B组大量结缔组织增生，再生神经纤维较少  图4c  C组有少量的新生轴突，排列不规则；图4d D组有较多髓鞘形成，SC再生较明显  图5  C组 髓鞘壁薄且不规则 ×2500倍  图6  D组  髓鞘壁厚且规则 ×2500倍。

【参考文献】
  ［1］ Ikeguchi R,Kakinoki R,Matsumoto T,et al. Peripheral nerve allografts stored in green tea polyphenol solution［J］.Transplantation,2005,6:688-695.

［2］ 杨小祥，冷 震，钱 塘，等. 超低温冷冻保存的吻合血管异体神经移植实验研究［J］.中国修复重建外科杂志,2006,3: 295-299.

［3］ 王 勇，葛宝丰，刘兴炎，等.组织块银浸染法在周围神经损伤组织学观察中的应用［J］.西北国防医学杂志,2006,3: 227.

［4］ 王秋根，应 明，鲁树荣，等.不同冷冻温度和保存时间对同种异体神经移植后神经功能影响的研究［J］.中华手外科杂志，1998，1:53-55.

［5］ Lee S,Suh S,Kim S. Protective effects of the green tea polyphenol(-)epigallocatechin gallate against hippocampal neuronal damage after transient global ischemia in gerbils［J］.Neuroscience Letters,2000,3:191-194.

［6］ Nie G,Cao Y,Zhao B. Protective effects of green tea polyphenols and their major component, (-)epigallocatechin3gallate (EGCG),on 6-hydroxydopamineinduced apoptosis in PC12 cells［J］.Redox Rep,2002,3:171-177.

［7］ 衷鸿宾，卢世璧，侯树勋，等.犬化学去细胞神经同种异体移植的早期观察［J］.中国矫形外科杂志，2002，12:1192-1194.

［8］ 许文静, 于海龙, 孙明学, 等. 化学去细胞同种异体神经移植术后病人的护理［J］.中国矫形外科杂志，2008，5:379-380.

作者单位：1.兰州大学第二临床医学院,甘肃 兰州,730000；2.兰州军区兰州总医院,a.骨科研究所,b.肌电图室，甘肃 兰州730050