不同培养条件下脂肪干细胞与软骨细胞共培养的研究

【摘要】  探讨病理状态下软骨细胞能否诱导脂肪干细胞(ADSC)向软骨细胞分化以及可能的最佳条件，以便为临床修复关节软骨损伤提供可能的新途径。［方法］分离共培养新西兰大白兔骨关节炎模型的ADSC和软骨细胞，根据不同血清浓度（10％ FBS和2％ FBS）和不同培养空间（纤维蛋白凝胶支架和无支架单层培养）分组，共培养14 d后，胰酶消化终止。倒置显微镜观察和透射电镜观察共培养后ADSC的形态变化。甲苯胺蓝染色法和免疫细胞化学检测共培养后ADSC的蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达水平。RTPCR检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。［结果］共培养7 d后部分ADSC变圆，14d时ADSC形态高度分化与成熟软骨细胞相似，其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高，尤以10％FBS支架共培养组最为明显。［结论］与病理状态下软骨细胞共培养后，ADSC可以被诱导成软骨样细胞。高浓度血清三维培养可以增强这种诱导作用。

【关键词】  脂肪干细胞； 软骨细胞； 共培养； 组织工程

Research of coculture of adipose derived stem cells and chondrocytes in different  culture  conditions ∥ZHANG Yong, ZHAO Jianning, HAN Ningbo. Department of Orthopaedic Surgery, Nanjing General Hospital of Nanjing Command,Second Military Medical University of Chinese PLA, Nanjing 210002, China

    Abstract：［Objective］To investigate the feasibility and optimal condition of in vitro chondrogenesis by coculture of adipose derived stem cell (ADSC) and chondrocytes in pathologic state so as to provide a new clinical approach for repairing damaged articular cartilage.［Method］ADSC and aricular chondrocytes from osteoarthritis model in adult New Zealand white rabbits were in vitro expanded and then seeded on plate and plugin type millicell dish respectively. The coculture cells were cultured in different conditions including different serum concentration (10% FBS and 2% FBS) and dimensions (fibrin scaffold and monolayer). The culture medium was changed every 3 days. The shape of ADSC before and after coculture was observed by inverted microscope and transmission electron microscope. The expression of aggrecan and type Ⅱ collagen genes in ADSC were studied by toluidine blue staining and immunohistochemistry after in vitro coculture for 14 days. And the transcription of aggrecan and type Ⅱ collagen genes in ADSC were studied by RTPCR. ［Result］The shape of ADSC was fibroblastlike cells morphologically. And they became round at 7 days after in vitro coculture. At 14 days after coculture with chondrocytes, ADSC was changed to chondrocytelike cells morphologically and increased immunostaining particles of type Ⅱ collagen and enhanced toluidine blue staining. And the transcription of type Ⅱ collagen and aggrecan genes was also increased,especially in the ADSC cultured in fibrin scaffold with 10% FBS. ［Conclusion］Chondrocytes in pathologic state may provide chondrogenic microenvironment to induce chondrogenic differentiation of ADSC in vitro, which will be enhanced by high serum concentration and threedimensional culture.

    Key words：adipose derived stem cell;  articular chondrocytes;  coculture;   tissue engineering

   关节软骨损伤的修复一直是骨科医生面临的巨大挑战。软骨组织工程为解决这一难题提供了新的方法。由于软骨细胞来源少，增殖有限，不能满足临床需要。因此，具有强大增殖和多向分化能力的干细胞，尤其是脂肪来源的间充质干细胞（adipose derived stem cell，ADSC）已成为软骨组织工程研究的热点［1,2］。然而，传统诱导干细胞的方法需要大量的生长因子，费用高，难以有效应用于临床。已知正常关节软骨微环境可以诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。由于临床上关节软骨损伤多见于陈旧性损伤或关节疾患，目前对病理状态下的关节软骨是否能诱导ADSC向软骨细胞分化尚不清楚。本研究通过在不同血清浓度（10％ FBS和2％ FBS）和不同空间（纤维蛋白凝胶支架和无支架单层）共培养来源于新西兰大白兔骨关节炎模型的ADSC和软骨细胞，探讨病理状态下软骨细胞是否能诱导ADSC向软骨细胞分化以及可能的最佳条件，以便为临床修复软骨损伤提供可能的新方法。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  清洁级成年新西兰大白兔，雌雄不限，体重1.5～2.0 kg，由南京军区南京总医院比较医学科提供。

    1.1.2   试剂  DMEM培养液和胎牛血清购自Gibco公司，Ⅰ、Ⅱ型胶原酶、逆转录酶、β-磷酸甘油钠、TGF-β1、维生素C和地塞米松购自Sigma公司，插入式细胞培养皿购自密理博公司，纤维蛋白原、凝血酶、甲苯胺蓝和油红O染液购自南京夏斯生物技术有限公司，碱性磷酸酶染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所，小鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体购自Calbiochem公司。

    1.2  方法

    1.2.1  骨关节炎模型的建立  取新西兰大白兔膝关节内侧约3 cm 切口，切除兔内侧半月板和前交叉韧带。置于笼中自由活动及进水。对侧膝关节作为对照组。6周后取材，大体观察和HE染色鉴定。

    1.2.2  ADSC和软骨细胞的分离与培养  取建模后新西兰大白兔的腹股沟皮下脂肪和膝关节股骨髁软骨组织。其中，脂肪剪碎，置于Ⅰ型胶原酶中消化1 h。DMEM培养液悬浮离心（1 200 r/min, 10 min）。沉淀的细胞用DMEM培养液悬浮接种。软骨组织经胰蛋白酶37℃水浴振荡消化30 min后剪碎，加入Ⅱ型胶原酶消化4 h。细胞悬液过滤后离心（1 500 r/min，10 min），弃上清，PBS洗涤细胞离心2次（1 000 r/min，5 min），接种。2～3 d换液1次。

    1.2.3  ADSC的鉴定（体外诱导成脂肪、骨和软骨细胞）  取第3代ADSC爬片，分别更换成脂诱导液、成骨诱导液和成软骨诱导液,每3 d更换培养液1次，培养14 d后终止，爬片固定。分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。

    1.2.4  纤维蛋白凝胶支架的制备  室温下将无菌的纤维蛋白原-DMEM溶液和含Ca+的凝血酶溶液按体积1∶1混匀,静置5 min后形成纤维蛋白凝胶支架。其中，纤维蛋白原的终浓度为40 mg/ml，凝血酶的终浓度为50 U/ml，Ca+的终浓度为40 mmol/l。

    1.2.5   ADSC与软骨细胞共培养  根据不同的血清浓度（10％ FBS和2％ FBS）、不同的培养空间（纤维蛋白凝胶支架和无支架单层）和是否共培养，分8组如下：10% FBS支架共培养组、10％ FBS支架未共培养组、2% FBS支架共培养组、2％ FBS支架未共培养组、10% FBS单层共培养组、10％ FBS单层未共培养组、2%FBS单层共培养组和2％FBS单层未共培养组。其中，共培养组是将分离培养的ADSC和软骨细胞(ADSC细胞数为1×106个/孔 ，软骨细胞数为2.5×105个/孔)分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿，培养液经0.4 μm的滤孔相通。每3 d换液1次，倒置显微镜观察ADSC的形态变化。培养14 d后，将ADSC种植于培养瓶和培养皿以便爬片和提取RNA。透射电镜观察各支架组中ADSC形态变化。

    1.2.6  免疫细胞化学和甲苯胺蓝染色分别检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达  分组同前。采用SP法进行染色，检测Ⅱ型胶原的表达。其中小鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体按1∶100稀释。0.1%甲苯胺蓝染色10 min后，脱水，透明，封片观察蛋白多糖的表达。

    1.2.7  RTPCR检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录：分组同前。按试剂盒说明操作。其中，Ⅱ型胶原引物为（Sense）5’-GCACCCATGGACATTGGAGGG-3’和(Antisense) 5’-GACACGGAGTAGCACCATCG-3’；蛋白多糖引物为（Sense）5’-ACATCCCAGAAAACTTCTTT-3’和 (Antisense) 5’-CGGCTTCGTCAGCAAAGCCA-3’。

    2  结  果

    2.1  骨关节炎模型的鉴定

    大体观察模型组关节软骨色泽灰暗，不平整，厚度变薄；对照组关节软骨平整呈淡蓝色，色泽明亮，微透明。HE染色示：模型组软骨表面粗糙，部分全层缺失；而对照组软骨表面平整，无缺失。表明骨关节炎模型被成功建立（图1）。

    2.2  ADSC鉴定

    ADSC原代呈集落样生长，传代后以梭形为主，排列规则。油红O染色显示成脂诱导后ADSC的胞浆内出现亮红色的颗粒。碱性磷酸酶检测发现成骨诱导后细胞着色呈红色。甲苯胺蓝染色显示成软骨诱导后细胞的胞浆呈蓝色。各对照组不显色或有较弱的非特异染色。上述实验证明分离的细胞具有多向分化能力，是脂肪来源的间充质干细胞。

    2.3  共培养后ADSC的形态学变化  共培养第7 d时，部分ADSC变圆，增殖速度明显减慢。而未共培养的ADSC仍以梭形为主，增殖迅速，其中以10%FBS支架共培养组变化最明显。共培养14 d后，透射电镜观察发现10%FBS支架共培养组中细胞形态高度分化与软骨细胞最相似，2%FBS支架共培养组中细胞形态也高度分化但有老化趋势，而未共培养组中细胞形态均呈低分化（图2）。

    2.4  共培养后ADSC的Ⅱ型胶原和蛋白多糖的蛋白表达水平

    甲苯胺蓝染色显示共培养后ADSC的胞浆出现蓝色。而未共培养组仅显示微弱的淡蓝色。Ⅱ型胶原免疫细胞化学显示共培养后脂肪干细胞的胞浆出现粗大的棕色颗粒，而未共培养组没有。表明共培养后ADSC蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达增高。二者均以10%FBS支架共培养组明显。

    2.5  共培养后ADSC的Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基因转录水平

    RTPCR显示共培养组条带较未共培养组增强，表明共培养14 d后ADSC的Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基因转录水平增高。其中，10%FBS支架共培养组的条带最强（图3）。

    图1  骨关节模型鉴定（HE染色）模型组软骨表面粗糙，部分全层缺失；而对照组软骨表面平整，无缺失（10×3.3）  图1a. 对照组,图1b.模型组  图2  支架共培养14d后ADSC的形态学变化：透射电镜观察发现10%FBS支架共培养组中细胞形态高度分化与软骨细胞最相似，2%FBS支架共培养组中细胞形态也高度分化但有轻度老化趋势，而未共培养组中细胞形态均呈低分化。（×1 000）  图2a.10%FBS支架共培养组  图2b.10％FBS支架未共培养组  图2c.2%FBS支架共培养组  图2d.2％FBS支架未共培养组    图3  共培养后ADSC的Ⅱ型胶原和蛋白多糖的基因转录水平：RT-PCR显示共培养组均有较强的条带，而未共培养组的条带较弱。其中，10%FBS支架共培养组的条带最强。

    3  讨  论

    　　完整的关节软骨是关节执行正常功能的基础。正常关节软骨损伤后自我修复能力有限。临床上常见的创伤、骨关节炎和关节软骨病均能造成软骨组织的损伤，引起关节表面的退变［3］。因此如何修复损伤的关节软骨一直是关节外科领域的难题之一。传统的钻孔、微骨折和软骨移植等方法存在软骨退变、排异反应和远期效果差等缺点［4］。虽然临床上通过组织工程技术，应用自身软骨细胞移植修复关节软骨缺损已取得较好效果，但是，由于软骨细胞来源少，供区损伤大，增殖有限，易发生去分化等［5］，因此，不能满足临床的广泛需求。另外，因为全层的关节软骨损伤常合并有软骨下骨的损伤，而正常的软骨下骨的生物力学特性可以防止软骨的退变。所以此类损伤需要同时修复软骨和软骨下骨，单纯的软骨细胞移植已不能满意修复。

    　　具有强大的自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞为解决这一难题提供了可能。目前常用的成体干细胞有骨髓来源的间充质干细胞和ADSC。尽管前者已被证实可以作为软骨组织工程良好的种子细胞，然而由于骨髓来源困难，供者痛苦，干细胞数量少，体外扩增时间长，价格昂贵，因此也难以满足临床需要。ADSC是Zuk PA等［6］于2001年首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中获得。已证实ADSC能向软骨细胞定向分化。提取ADSC的方法简单，来源充足，获得的成体干细胞数量大，并且细胞数量不会因为年龄增加而减少。与骨髓来源的干细胞相比，ADSC增殖迅速，其倍增时间一般不随传代次数增加而延长。体外培养的ADSC的生物学特性与骨髓干细胞相似，而且非常稳定，冻存6个月后的ADSC仍能保持增殖能力和多向分化潜能［7］。有学者研究还发现，传代的ADSC 的HLADR表达降低，说明免疫原性低，可进行异体移植［8］。此外，ADSC不仅能向软骨细胞分化，还能向骨细胞分化，可以满足累及软骨下骨的关节软骨损伤修复的需要。因此，ADSC可能是软骨组织工程较理想的种子细胞。但是，目前在诱导ADSC向软骨细胞定向分化过程中存在需要大量细胞因子的参与、成本高、难以构建大块软骨等问题。

    研究表明体内的软骨细胞微环境在干细胞的诱导分化中起重要作用。此微环境不仅包括了细胞分泌的生长因子，同时还包括了相邻细胞间的相互作用等。有学者发现，软骨细胞条件培养液可以显著提高间充质干细胞中软骨细胞外基质如Ⅱ型胶原的表达，这说明关节软骨细胞可能通过分泌某些形态发生因子诱导间充质干细胞向软骨细胞分化［9］。软骨细胞不仅可分泌多种生长因子如TGFβ和IGF1等，同时还能分泌组成软骨微环境的特异性细胞外基质，如Ⅱ型胶原和蛋白多糖等，对软骨细胞的分化、增殖、粘附及细胞间信号传导起着非常重要的作用。其中，TGFβ和IGF1可以协同诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化。有学者报道，与软骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞，可以分化为软骨细胞，并在体外成功构建软骨组织［10］。共培养的方法可以在无需生长因子的条件下，使成体干细胞向软骨细胞分化，这种方法可能更为经济有效。另有研究还发现，ADSC与髓核组织共培养后，ADSC中的Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达显著增高［11］。目前对软骨细胞是否能诱导ADSC向软骨细胞分化还不清楚。

    组织工程构建软骨不仅要求短期内获得大量的种子细胞，而且还需要在体外培养中保持良好的细胞表型。尽管单层培养的脂肪干细胞在成软骨培养基诱导下，也可以形成软骨细胞，但是它的表型及基质分子的表达不稳定。有报道，三维培养有利于细胞间相互作用，促进ADSC向软骨细胞分化，增加细胞外基质的合成以及细胞表型的维持［12,13］。本研究中采用的纤维蛋白凝胶支架孔隙率好，有利于ADSC之间的细胞相互作用。已证实，血清浓度不仅影响细胞增殖还可以影响细胞的分化。由于血清成分复杂，何种浓度的血清最适合ADSC的增殖分化尚不清楚，而合适的血清浓度对于体外诱导ADSC向软骨细胞分化是非常重要的。

    本试验发现，与病理状态下软骨细胞共培养14 d后，ADSC的形态呈软骨细胞样改变，其Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达增高，尤以在三维空间10％FBS培养条件下增高明显。这说明病理状态下软骨细胞可能提供成软骨微环境诱导ADSC分化为软骨样细胞，而高浓度血清三维培养条件可以增强这种诱导作用。当然，血清质量的不同，可能会影响试验的结果。至于软骨细胞如何诱导ADSC定向分化为软骨细胞以及体内修复关节软骨损伤效果如何，还需要进一步研究。

【参考文献】
  ［1］ 郝 伟，胡蕴玉，魏义勇，等. 兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及成骨诱导分化研究［J］. 中国矫形外科杂志，2006，21：1657-1660.

［2］ Xu Y, Balooch G, Chiou M, et al. Analysis of material properties of early chondrogenic differentiated adiposederived stromal cells (ASC) using an in vitro threedimensional micromass culture system［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2007,2: 311-316.

［3］ Marlovits S, Zeller P, Singer P,et al. Cartilage repair:generations of autologous chondrocyte transplantation［J］. Eur J Radiol, 2006, 1:24-31.

［4］ Redman SN, Oldfield SF, Archer CW. Current strategies for articular cartilage repair［J］.Eur Cell Mater, 2005,14: 23-32.

［5］ English A, Jones EA, Corscadden D,et al. A comparative assessment of cartilage and joint fat pad as a potential source of cells for autologous therapy development in knee osteoarthritis［J］. Rheumatology (Oxford), 2007, 11: 1676-1683.

［6］ Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implication for cell-based therapies［J］. Tissue Engineering, 2001, 2: 211-227.

［7］ Gonda K, Shigeura T, Sato T, et al. Preserved proliferative capacity and multipotency of human adiposedderived stem cells after longterm cryopreservation［J］. Plast Reconstr Surg, 2008, 2: 401-410.

［8］ McIntosh K, Zvonic S, Garrett S, et al. The immunogenicity of human adiposederived stem cells: temporal changes in vitro［J］.Stem Cells, 2006,5: 1246-1253.

［9］ Hwang NS, Varghese S, Puleo C, et al. Morphogenetic signals from chondrocytes promote chondrogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells［J］. J Cell Physiol, 2007, 2: 281-284.

［10］周广东，苗春雷，王晓云，等.软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究［J］.中华医学杂志,2004, 20：1716-1719.

［11］Li X, Lee JP, Balian G, et al. Modulation of chondrocytic properties of fatderived mesenchymal cells in cocultures with nucleus pulposus［J］. Connect Tissue Res, 2005, 2: 75-82.

［12］Winter A, Breit S, Parsch D, et al. Cartilagelike gene expression in differentiated human stem cell spheroids: a comparison of bone marrow-derived and adipose tissueerived stromal cells［J］. Arthritis Rheum, 2003, 2: 418-429.

［13］吕昌伟，胡蕴玉，崔玉明，等. 应力环境下三维诱导组织工程种植细胞修复关节软骨缺损［J］. 中国矫形外科杂志，2004，1：74-76.

作者单位：第二军医大学南京临床医学院 南京军区南京总医院骨科，南京 210002