强力霉素对兔制动骨关节炎模型的治疗作用

【摘要】  ［目的］探讨强力霉素对兔制动骨关节炎模型的治疗作用及其作用机制。［方法］新西兰大白兔24只，随机分为正常、模型、对照和治疗组，每组6 只。除正常组外，所有动物以石膏固定左下肢于伸直位4周。然后治疗组给予强力霉素口服治疗，4周后观察股骨内髁的退变情况，并检测软骨Ⅱ型胶原含量、尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinasetype plasminogen activator,uPA）和基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase,MMP）-13水平。［结果］治疗组软骨退变较模型和对照组明显减轻，模型与对照组之间Ⅱ型胶原含量、uPA和MMP-13的表达无统计学意义（P>0. 05），其它各组均有显著统计学差异（P<0. 01）。uPA与MMP-13的表达呈正相关（r=0. 973,P<0. 05）。［结论］强力霉素可抑制软骨退变，改善软骨结构。其作用与uPA、MMP-13的表达抑制有关。

【关键词】  骨关节炎； 强力霉素； 尿激酶型纤溶酶原激活剂； 基质金属蛋白酶

Therapeutical effects of doxycycline on rabbit immobilized osteoarthritis∥ZHANG Shangpu,SHI Chenhui,ZHAO Jin.Department of Orthopaedic Surgery,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832008,China

    Abstract：［Objective］To investigate the effects of doxycycline on rabbit immobilized osteoarthritis and their mechanism.［Method］Twentyfour rabbits were randomly divided into normal,model,control and treatment groups,with 6 rabbits in each group.All of the animals were immobilized the lower left limbs with plaster bandage for 4 weeks except normal group.Doxycycline was orally given to treatment group.Cartilage degeneration of the medial condyle of femur was observed at 4 weeks and the levels of collagenⅡ,uPA and MMP13 were tested.［Result］Cartilage degeneration in treatment group was significantly slighter than those in model and control groups.Data of collagenⅡ,uPA and MMP13 between model and control groups had no significant difference,but  a noticeable statistical difference among other groups.The uPA activity was positively correlated with MMP13.［Conclusion］Doxycycline inhibits the degeneration process of cartilage and improves the structure.The effects may be related to the inhibition of uPA and MMP13.

    Key words：osteoarthritis;     doxycycline;     urokinasetype plasminogen activator;     matrix metalloproteinase

    骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种渐进性的退行性关节病，其发病与增龄、遗传、外伤等因素有关。关节生理环境失衡导致的炎症性级联反应在OA的发病中起着重要的作用［1］。而针对病理生理学改变的OA病情改善药物成为目前研究热点。本实验用强力霉素治疗兔制动OA模型来探索其治疗价值。

    1     材料和方法

    1.   1     动物及试剂

    　　新西兰大白兔（新疆医科大学实验动物中心，医动字第16-003号）；强力霉素片（常州制药厂，批号：07121015）；Ⅱ型胶原单克隆抗体（Merck）；MMP-13单克隆抗体（CHEMICON）；uPA抗体（武汉博士德）。

    1.   2     模型的建立与分组

    　　健康成年新西兰大白兔24只，雌雄各半，平均体重约2.   5 kg，随机分为正常、模型、对照和治疗组，每组6只，正常组不予特殊处理，其他各组动物以石膏固定左下肢制作OA模型，固定范围自腹股沟下2.   0 cm 处至足趾，膝关节伸直位，踝关节背伸60°。4周后去除石膏，处死模型组动物，观察左膝关节退变情况，然后治疗组给予强力霉素25 mg/d，分2次灌胃治疗，对照组给予等量生理盐水。于用药4周后同时处死，观察比较。

    1.   3     组织取材

    　　先行左膝关节大体观察，然后以锐利刀片小心切取股骨内侧髁负重区同部位钙化层上软骨约3 mm×5   mm,10%中性甲醛溶液中固定后，做成石蜡切片，留做免疫组化染色，测定Ⅱ型胶原含量和uPA、MMP-13的表达情况；再将剩余全层软骨一并切除，进行HE染色和甲苯胺蓝染色。

    1.   4     检测指标

    　　关节软骨甲苯胺蓝染色，Mankin评分；免疫组化染色结果以Olympus dp70数码成像分析系统，在高倍镜下随机选取10个视野，分区测定Ⅱ型胶原IOD值与uPA和MMP-13阳性细胞占总细胞数的比率。

    1.   5     数据处理

    　　所得数据以±s表示，应用SPSS 13.   0软件处理，进行方差分析和t检验。

    2     结     果

    2.   1     大体与光镜观察

    正常关节软骨面光滑，瓷白色，无溃疡及缺损。光镜下层次清晰，无裂隙，潮线完整，细胞排列有序。模型组关节内有黄褐色积液，关节囊增厚，滑膜增生，软骨面有糜烂溃疡，甚至缺损，周围软骨增厚变软，呈灰黄色，关节边缘可见骨赘形成。光镜下染色不均，部分区域全层软骨缺损，缺损区周围细胞和基质增生明显，细胞数增多，紊乱，甲苯胺蓝染色淡染。对照组增生反应仍较明显。细胞增生，簇集，结构紊乱，细胞簇集处甲苯胺蓝染色加深，远离部位染色仍较淡。治疗组退变较轻，缺损区周围软骨面较光滑，色泽稍暗，无明显骨赘。镜下软骨增生不明显，结构较规则，甲苯胺蓝染色轻度减退，细胞数基本正常（图1）。

    2.   2     Ⅱ型胶原免疫组化测定

    正常软骨Ⅱ型胶原染色均匀分布于钙化层以上的各层软骨，模型组和对照组主要集中在软骨深层，不均匀，呈斑片状深染区域，表中层表达明显减少，IOD值显著低于治疗组（P<0.   01），治疗组染色较正常组淡，主要分布于移行层中下部和深层上部。

    2.   3     MMP-13和uPA免疫组化测定

    正常软骨MMP-13和uPA仅有微弱表达，模型组和对照组表达明显增强，对照组MMP-13较模型组为弱（P<0.   05），模型组与对照组uPA表达无统计学差异（P>0.   05），治疗组两者表达均明显减弱（P<0.   01）（表1、图2）。MMP-13与uPA的表达呈正相关（r=0.   973,P<0.   05）。表1     各组指标Mankin评分，Ⅱ型胶原免疫组化、MMP-13免疫组化测定结果

　　3     讨     论

    强力霉素是四环素类药物。除抗生素作用外，它还可通过多种途径对OA软骨起保护作用［2］。MMP是软骨降解的主要蛋白酶之一，能直接降解软骨的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，破坏软骨结构。MMP-13在关节软骨降解中起主要作用［3］。强力霉素则可以通过其螯合Zn2+和Ca2+的特性抑制MMP的活性，使病情得到改善。本实验正常组MMP-13仅有微弱表达，模型组和对照组呈高表达。强力霉素治疗后，退变软骨的损伤性反应明显减轻，MMP-13活性明显低于模型组和对照组（P＜0.   01）。

    uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，主要通过与uPAR结合发挥作用，但uPA也可将纤溶酶原激活为纤溶酶，间接激活其他蛋白水解酶以及直接降解细胞外基质和基底膜等［4］。MMP的激活因子可由软骨细胞产生的uPA利用纤溶酶原生成的纤溶酶激活，从而使OA关节软骨中MMP的表达增高，Ⅱ型胶原被裂解而变性。研究表明，uPA介导的细胞外基质蛋白裂解作用与OA的关节软骨和骨的破坏密切相关［5］。本实验中，正常组uPA仅有微量表达，模型组和对照组的表达明显增高，治疗组表达明显减弱，与MMP-13表达呈正相关。表明强力霉素并不仅是MMP-13的抑制剂，同时对uPA的表达也有抑制作用，可能是一种潜在的uPA抑制剂。

    　　关节软骨损害是OA的基本病理变化，而软骨细胞外基质的合成与降解失衡是造成软骨退变的重要原因之一。正常情况下，软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等细胞外基质，同时还合成少量的uPA、MMP以及它们的天然组织抑制剂，以维持软骨的正常新陈代谢。OA时，关节软骨细胞克隆，基质合成加速，但新合成的软骨细胞外基质最终不足以维持正常的软骨结构，从而发生了软骨的进行性破坏。本实验模型组关节软骨有明显的增生性反应，但是增生组织结构紊乱，已失去正常的关节软骨功能。治疗组关节软骨结构明显改善，Mankin评分和Ⅱ型胶原的含量明显增高（P＜0.   01），对照组则变化不明显。考虑为强力霉素抑制了uPA和MMP-13的表达，使软骨的结构和功能趋向正常化。但是对于已经造成的软骨损伤则无法恢复，只能由纤维软骨增生替代。

    　　目前OA的治疗仍以缓解症状为主。而病情改善药物与症状改善药物的合理搭配，可能是一种更为合理的治疗方案［6］。本实验表明，强力霉素能有效抑制uPA和MMP-13的表达，改善软骨的结构和功能，可能是一种有效的病情改善药。本实验为进一步的临床研究提供了相关理论依据。

【参考文献】
  ［1］ Krasnokutsky S,Samuels J,Abramson SB.Osteoarthritis in 2007［J］.Bull NYU Hosp Jt Dis，2007,3:222-228.

［2］ 李 兵,吴志宏,邱贵兴.四环素类抗生素治疗骨关节炎的作用机制及应用前景［J］.中国矫形外科杂志,2007,3:197-199.

［3］ Mitchell PG,Magna HA,Reeves LM,et al.Cloning,expression,and typeⅠ collagenolytic activity of matrix metalloproteinase13 from human osteoarthritic cartilage［J］.J Clin Invest,1996,97:761-768.

［4］ Alfano D,Franco P,Vocca I,et al.The urokinase plasminogen activator and its receptor:role in cell growth and apoptosis［J］.Thromb Haemost， 2005,2:205-211.

［5］ Lavigne P,Benderdour M,Lajeunesse D,et al.Subchondral and trabecular bone metabolism regulation in canine experimented knee osteoarthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage,2005,4:310-317.

［6］ Cawston TE,Wilson AJ.Understanding the role of tissue degrading enzymes and their inhibitors in development and disease［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol,2006,5:983-1002.

作者单位：石河子大学医学院 a.第一附属医院骨科；b.病理教研室，新疆 832008