异种化学去细胞神经移植修复大鼠坐骨神经缺损的功能评价

【摘要】  ［目的］评价异种化学去细胞神经移植修复大鼠坐骨神经缺损后神经功能恢复，从而为临床应用去细胞异种神经移植修复神经缺损提供更为充分的理论依据。［方法］雄性Wistar大鼠15只，致左侧坐骨神经1 cm缺损，以等粗兔化学去细胞神经移植修复。每2周测定坐骨神经指数，移植后4个月动物麻醉后暴露移植段神经，刺激近侧神经干、于同侧胫后肌群记录运动诱发电位，之后取移植段神经切片后行HE组织化学及NF-160免疫组织化学染色。 ［结果］去细胞异种神经移植物未被宿主排斥，大量神经纤维长入移植物，神经电生理及坐骨神经指数显示宿主坐骨神经功能有部分恢复。［结论］去细胞异种神经移植可以作为修复周围神经缺损的一种有效方法。

【关键词】  外周神经缺损； 去细胞异种神经移植； 功能恢复

Regeneration of rat sciatic nerve inhanced by chemical acellular xenogeneous nerve grafts:a functional evaluation∥ZHAO Zhigang,CHEN Bingyao,WEI Haiwen,et al.Department of Orthopaedics,the PLA  89th Hospital,Weifang 261021,China

    Abstract：［Objective］To observe the nerve regeneration and functional recovery in the adult rats.［Method］The sciatic nerves on the left side of 15 rats were exposed and 1.0 cm long segments of the nerves were removed from the midthigh level and replaced by rabbit nerve made acellular through chemical extraction.At 4 months after procedure,the nerve regeneration and function recovery were examined with HE staining,NF160 immunohistochemical staining,electrophysiological tests and sciatic functional index (SFI).［Result］In the rats repaired by acellular nerves,regenerated axons reentered into the acellular xenonerve segments without excessive sign of inflammation following implantation.As stimuling(1.5 mA,0.1 ms,1.0 Hz) to the proximal sciatic nerves,the implanted segment resulted in motor evoked potentials,which were recorded from posterior tibial muscles.SFI showed a partial recovery of locomotion of the limb with sciatic nerve defect.［Conclusion］Sciatic nerves defect can be repaired by chemical acellular xenogeneous nerves in rats.There was partial functional recovery,which revealed the grafting with chemical acellular xenogeneous nerves may be a promising mehod for nerve defect in clinical.

    Key words：peripheral nerve defect;     acellular xenogeneous nerve transplantation;     functional recovery

     周围神经的缺损在战创伤中十分常见，其修复一直是医学界的一个棘手问题。在临床上，  自体神经移植是最基本和最可靠的方法。但自体神经移植来源有限，移植神经多为腓肠神经等的细小皮神经，无法满足较大神经缺损和广泛神经缺损修复的需要，  同时，自体神经移植不可避免的会造成二次创伤、供区功能障碍、感觉缺失、瘢痕形成和神经瘤性疼痛等，故在临床应用上受到限制。近年来，有学者发现，对同种异体神经进行特定的化学萃取处理，可清除神经中的细胞及髓鞘成分从而基本消除抗原性，同时由于保留了神经的基管膜及板层结构而成为神经纤维再生的良好支架，他们相继以化学去细胞同种异体神经移植修复大鼠、兔及犬的坐骨神经缺损获得成功［1～ 3］，目前已有临床应用的报道［4］。但临床上同种异体神经来源并不充分，因此有可能使其应用受到限制。在前期研究中作者应用化学萃取去细胞兔神经分支移植修复大鼠坐骨神经缺损，移植后未见明显免疫排斥反应，大量再生纤维长过移植物，同时见宿主雪旺细胞随再生纤维迁移进入移植物并形成髓鞘［5～ 6］。上述结果初步提示应用化学去细胞异种神经修复外周神经缺损的可能性。本实验通过行为学观察、动态坐骨神经指数测定及电生理检测，  对兔化学去细胞神经移植修复大鼠神经缺损后神经功能变化进行综合评价，进一步探讨经化学萃取的去细胞神经用于异种周围神经移植的可行性，为临床应用提供更为确实的依据。

    1     材料与方法

    1.   1     实验动物

    雄性新西兰大白兔1只，体重2.   5 kg；雄性Wistar大鼠15只，体重200～ 250 g。以上动物由解放军第89医院动物实验室提供。

    1.   2     兔神经取材及化学去细胞处理

    1.   2.   1     兔臂丛神经取材     846合剂(0.   15 ml／kg体重)麻醉动物，暴露双侧臂丛，剪取直径约1.   5 mm，长度超过1.   0 cm的分支，按后述方法处理。

    1.   2.   2     化学去细胞处理     参考Sondell等的方法［2］，将新鲜取材的神经置蒸馏水中清洗，除去表面的组织碎块及纤维膜，然后按下面的程序处理：(1)蒸溜水浸浴7 h，换水2次；(2)震荡器中(150转／分)3.   0％Triton X-100溶液消化12 h；(3)蒸馏水浸浴1 h；(4)震荡器中(150转／分)4.   0％脱氧胆酸钠溶液消化24 h。重复以上步骤1次，蒸馏水清洗后将处理好的神经置无菌PBS液(pH 7.   2)中，4℃冰箱保存备用。

    1.   2.   3     大鼠坐骨神经缺损模型制作及神经移植过程     0.   5％戊巴比妥钠(40～ 60 mg／100 g体重)麻醉Wista大鼠，  自臀部肌间隙暴露左侧坐骨神经，自第一个肌支以上切除0.   8 cm，以1.   0 cm长化学去细胞兔神经分支移植修复，局部滴入硫酸庆大霉素注射液3～ 4滴，逐层关闭切口。分笼饲养。

    1.   3     观察指标

    1.   3.   1     大体行为学观察     置实验鼠于平地，观察手术侧下肢运动情况。

    1.   3.   2     坐骨神经功能指数(scimic functional index，SFI)测定     采用沈宁江［7］等的改良方法于术前及术后每2周测定实验侧足(E)、正常侧足(N)的足印长度(PLF)、足距宽度(TSF)、中间足趾宽度(ITF)，直至术后4个月。将数据代入Bain公式，计算SFI及其恢复率。

    SFI=-38.   3［(EPL-NPL)／NPL］+109.   5［(ETS-NTS)／NTS］+13.   3［(EIT-NIT)／NIT)］

    正常大鼠SFI为0，坐骨神经完全离断指标为-100。

    1.   3.   3     神经电生理观察     术后4个月，实验动物用0.   5％戊巴比妥钠麻醉，暴露并游离移植段神经及对侧正常坐骨神经，行胫骨后肌群运动诱发电位测定。刺激电极置于移植段近侧约2 mm处(正常侧为对应位置)，记录电极经皮刺入胫骨后肌群，刺激参数：0.   8～ 1.   5 mA 0.   1 ms 1.   0 Hz。测量诱发电位潜伏期及波幅，每只动物重复测定3次，取平均值。

    1.   3.   4     组织学观察     完成电生理测定后，处死实验动物，取移植段神经，石蜡包埋，纵行切片(片厚5 μm)，分别行HE染色及NF-160免疫组织化学染色(常规ABC法)。

    1.   4     统计学处理

    数据以均数±标准差的形式表示，数据间用SPSS 10.   0软件行配对t检验，P<0.   05为差异显著性标准。

    2     结     果

    2.   1     行为学观察

    手术后大鼠术侧下肢运动功能丧失，拖地行走，足趾并拢，针刺足底无动作反应。术后3周开始，膝踝关节活动恢复，足趾逐渐分开并恢复足底行走，针刺足底有退缩逃避反应。但伤侧跛行明显，协调性欠佳。

    2.   2     坐骨神经功能指数(sciatic functional index，SFI)

    自术后4周开始逐渐恢复，最终恢复率超过50％。

    图1     去细胞异种神经移植后SFI变化图

    2.   3     电生理检测

    去细胞异种神经鞘膜管移植组刺激移植段近侧神经，于胫骨后肌群可记录到运动诱发电位，3次记录重复性良好。与对侧正常神经比较，其潜伏期延长，波幅较低(图2，表1)。表1     胫骨后肌群运动诱发电位比较

    2.   4     组织学观察

    去细胞异种神经移植组局部神经连续性良好，移植段周围轻度粘连，吻合口轻度膨大。HE染色显示，吻合口处神经结构连续性良好，神经纤维再生长入移植段，但排列紊乱(图3a)，在移植段内可见大量NF-160免疫反应阳性的新生纤维(图3b)。

    3     讨     论

    在前期实验中，作者应用经化学萃取的去细胞兔周围神经分支移植修复大鼠坐骨神经缺损，发现经化学萃取处理后的异种神经具有良好的组织相容性，再生神经纤维可以成功长过移植物，同时宿主雪旺氏细胞可以随再生纤维进入移植神经，围绕再生纤维排列成条索状并形成髓鞘包裹再生纤维［5～ 6］。但这些神经再生能否获得神经功能及运动能力的恢复尚不清楚。本实验在前期工作的基础上，从功能恢复的角度对化学去细胞异种神经移植修复周围神经缺损的效果进行评价。实验结果发现，成年大鼠坐骨神经缺损应用化学萃取去细胞兔臂丛神经分支移植修复后，损伤侧下肢运动功能自术后3周开始逐步改善，最终恢复足底行走能力，但协调性及力量较对侧差，进一步的坐骨神经功能指数分析亦显示了这种进行性的运动功能恢复，恢复程度在术后3个月以后达到高峰，SFI最终恢复率达到57％。自近侧吻合口近段刺激神经干，胫后肌群可记录到诱发电位，表明神经电传导功能恢复，与正常侧对比，潜伏期延长、波幅降低。组织学观察结果发现，再生纤维可成功长过移植物，这与以前的发现一致。

    上述实验结果表明，异种去细胞神经移植修复大鼠坐骨神经后，不仅能成功支持神经再生，而且神经电传导及下肢运动功能部分恢复。这种恢复虽然远未达到正常，但实验鼠恢复了有效的负重行走能力。这进一步提示在自体神经应用困难、异体神经来源受限的情况下，临床应用去细胞异种神经修复神经缺损的可行性。当然在引入临床应用之前，有必要对其安全性及有效性进行更为全面的评价，这包括：与自体神经移植、去细胞同种异体神经移植或其它神经缺损修复方法做比较以确定去细胞异种神经移植的优劣，通过对移植后不同时间点的免疫学指标的测定全面了解免疫排斥情况，建立大动物模型了解移植神经直径及长度对神经再生、宿主雪旺氏细胞迁入及神经功能恢复的影响等等。

【参考文献】
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［2］ Sondell M，Lundborgq G,Kanjie M．Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction［J］．Brain Research,1998,1-2：44-54.

［3］ 衷鸿宾，卢世璧，侯树勋，等．去细胞神经同种异体移植的运动功能恢复［J］．中华创伤杂志，2002，9：533-535.

［4］ 郭义柱，卢世璧，王 岩,等．去细胞同种异体神经移植修复人体长段周围神经缺损［J］．中国临床康复，2005，38：26-27.

［5］ 陈秉耀，侯树勋，赵 敏．化学去细胞异种神经移植后宿主的许旺细胞在移植物内的增殖［J］．中华显微外科杂志，2006，39：350-352.

［6］ 陈秉耀，侯树勋，衷鸿宾．兔化学去细胞神经移植修复大鼠坐骨神经缺损［J］．中国矫形外科杂志，2003，11：1476-1478.

［7］ 江 宁，朱家凯．坐骨神经指数在神经功能评价中的应用［J］.中华显微外科杂志，1993，4：284-287.

作者单位：1.解放军第89医院全军创伤骨科研究所，山东 潍坊 261021；2.解放军总医院第一附属医院全军骨科研究所，北京 100037