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【摘要】 [目的]探讨非创伤性股骨头坏死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head ，NONFH)股骨头局部碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenic proteins，BMP-2)表达的变化情况及其意义。[方法]收集经全髋关节置换术取下的NONFH的股骨头标本30例作为实验组，新鲜股骨颈骨折标本10例作为对照组。于坏死区、健存区取材，经固定、脱钙后，制成切片，光镜观察其病理变化，并运用原位杂交技术分别对其bFGF与BMP-2的表达情况进行检测。[结果]实验组组织结构紊乱，破碎，骨小梁稀疏、不完整，有大量的空骨陷窝，而对照组骨小梁相对较完整、排列整齐，骨小梁中的骨细胞清晰可见，偶见空骨陷窝。实验组中bFGF与BMP-2的阳性表达强度及面积均明显低于对照组，结果有统计学意义(P<0.05)。[结论]NONFH股骨头局部bFGF与BMP-2表达的降低，极有可能是导致其自身修复能力不足的重要原因。增加股骨头局部bFGF与BMP-2的表达可能有助于股骨头缺血坏死的修复。
【关键词】 非创伤性股骨头坏死; 碱性成纤维细胞生长因子; 骨形态发生蛋白-2; 表达
Expression of bFGF and BMP-2mRNA of the local femoral head in nontraumatic osteonecrosis of femoral head∥NIU Dong-sheng，BAI Zhi-gang，WANG Wei-jun，et al.Orthopedic Department,Ningxia People’s Hospital ，Yinchuan 750021, China
Abstract: To explore the change and its significance of the expression of basic fibroblastic growth factor (bFGF) and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) of the local femoral head in nontraumatic osteonecrosis(NONFH). Thirty samples of femoral heads of NONFH were collected as the experimental group and 10 fresh samples of femoral heads of femoral neck fracture as control group. The specimens were collected at the time of total articular replacement arthroplasty. The bone tissues from necrosis area and healthy area were made into general sections after immobility and decalcification. Pathological changes were exexamined by optical microscopy and the expression of bFGF and BMP-2 in femoral head was determined with in-situ hybridization technique.The organization structure of experimental group was disorganized, cracked，and the bone trabecula was rarefactive and non-intact . There were a great number of empty lacune in bone trabecula. The intensity and area of positive expression of bFGF and BMP-2 in femoral head of the experimental group were obviously lower than that of control group. The result had statistical significance(P<0.05).The decreased expression of bFGF and BMP-2 in femoral head of NONFH may be reason for insufficient repair function.
Key words：nontraumatic osteonecrosis of femoral head; basic fibroblastic growth factor; bone morphogenetic protein-2; expression
非创伤性股骨头坏死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head ，NONFH)是临床上常见的骨科疾病，其常用的治疗方法远期疗效并不理想，至病程晚期多数会出现关节面塌陷而需人工关节置换。股骨头坏死的自行修复能力有限，常遗留软骨下骨坏死不能修复[1、2]，而造成这种现象的确切原因尚不明确。股骨头坏死区的血管再生及新骨形成，是其病理逆转的重要因素之一，也是治疗股骨头坏死的关键[2]。Mont等[3]提出应用细胞因子治疗股骨头坏死具有广阔的前景，bFGF和BMP-2是近年来研究较深入的两种生长因子。本文通过对NONFH人体股骨头标本中bFGF与BMP-2表达的研究，探讨影响股骨头局部骨形成、骨修复的原因，为临床防治提供新的思路与理论依据。
1 资料和方法
1.1 一般资料 股骨头标本均来源于全髋关节置换术。实验组30例，男性21例，女性9例;年龄38～77岁，平均(55.3±9.6)岁，Ficat分期，Ⅲ期13例，Ⅳ期17例;其中，服用激素者16例，酗酒者10例，原因不明者4例。对照组10例均为新鲜股骨颈骨折标本(伤后3 d内手术)，男性7例，女性3例;年龄41～80岁，平均(58.5±11.2)岁;且排除风湿、类风湿、心血管及免疫系统等疾病，并无烟酒嗜好及服用激素史。
1.2 主要试剂 bFGF原位杂交检测试剂盒(MK1054)，BMP-2原位杂交检测试剂盒(MK1782-h)，DAB显色试剂盒等(均由武汉博士德生物工程有限公司提供)。其中，bFGF所包含的mRNA探针为：
①5’-GGCTT CTTCC TGCGC ATCCA CCCCG ACGGC-3’;
②5’-AGCAG AAGAG AGAGG AGTTG TGTCT ATCAA-3’;
③5’-TGGAA TCTAA TAACT ACAAT ACTTA CCGGT-3’。
BMP-2所包含的mRNA探针为：
①5’-AGCAT GTTCG GCCTG AAACA GAGAC CCACC CCCAG-3’;
②5’-GCACC AAGAT GAACA CAGCT GGTCA CAGAT AAGGC-3’。
1.3 标本制作 将股骨头沿冠状面对半剖开，于坏死区(包括负重区关节软骨及软骨下坏死区域)、健存区(包括坏死区以远硬化带及髓心部分)各凿取一块约1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，所有标本经固定、脱钙后，常规石蜡包埋、切片，厚度为5 μm。
1.4 光镜观察 HE染色后，在高倍光学显微镜(100及400倍)下观察其组织病理学变化。
1.5 原位杂交测定bFGF mRNA与BMP-2mRNA 实验步骤严格按照说明书操作。以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达，以PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选取5个骨小梁视野和5个髓腔内视野，以IPP(Image-Pro Plus 5.1)图像分析软件及Smartscape 2002生物显微图像分析软件测定其阳性染色面积占整个视野面积的百分比和平均灰度值，取算数平均数作为每张切片的平均染色面积百分比和平均灰度值，前者代表bFGF mRNA或BMP-2 mRNA分布面积的大小，后者代表单位面积内bFGF mRNA或BMP-2 mRNA的含量。
1.6 统计方法 数据均以均数±标准差表示，应用SPSS 11.5软件统计分析，两组数据间采用两独立样本t检验及直线相关检验。r为相关系数，-1≤r≤+1 表示两变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负正相关。P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 组织形态学观察
2.1.1 大体改变
对照组：肉眼观股骨头球形外观存在，关节表面完整、光滑;剖面见关节软骨厚度均匀一致，软骨下骨小梁清晰可见。
实验组：肉眼观股骨头形态不规则，关节面凹凸不平，股骨头负重区有面积不等的软骨剥脱、缺失，部分标本负重区塌陷;剖面见关节软骨薄厚不均，负重区可见软骨剥脱及塌陷，软骨下可见囊性变区，内为类肉芽样组织，其下为硬化带。
2.1.2 光镜改变
对照组：软骨结构较完整，骨小梁粗大、密集、排列整齐，软骨细胞及骨细胞清晰可见，核大，位于中央，偶可见空骨陷窝，可见形态正常的黄骨髓(图1)。
实验组：关节软骨脱落、碎裂，空骨陷窝多见;软骨下为坏死区，骨小梁稀疏、变细、破碎明显;可见到坏死骨被纤维组织所包裹、取代，破骨细胞散在其间;坏死区无明显血管再生及骨修复。骨髓组织坏死明显，髓腔内脂肪细胞明显增生、肥大(图2)。
2.2 原位杂交技术检测bFGF mRNA的表达 两组切片均可见到阳性表达，在纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、破骨细胞、间质细胞等细胞中均有表达，骨细胞中则无明显表达。其中，实验组阳性表达的强度及面积百分比要明显低于对照组，结果有统计学意义(P<0.05)(见表1，图3～6)。
表1 bFGF mRNA阳性表达平均灰度值与面积百分比(x-±s)组别n平均灰度值(%)面积百分比(%)对照组1048.43±4.9623.99±6.43实验组3075.20±7.238.06±3.54 t’值-10.8537.475P值0.0000.0002.3 原位杂交技术检测BMP-2 mRNA的表达 两组切片均可见到阳性表达，在软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞、纤维细胞及间质细胞中均有表达，在骨细胞中很少表达。实验组阳性表达的强度及面积百分比要明显低于对照组，结果有统计学意义(P<0.05)(见表2，图7～10)。
表2 BMP-2mRNA阳性表达平均灰度值与面积百分比(x-±s)组别n平均灰度值(%)面积百分比(%)对照组1052.35±5.3820.78±5.41实验组3078.31±6.756.83±3.13t’值-11.0187.734P值0.0000.0002.4 bFGF与BMP-2表达的相关性分析
将实验组与对照组bFGF与BMP-2表达的平均灰度值做直线相关检验，结果表明二者呈正的直线相关关系，相关系数r为0.741，P<0.01。 图1对照组关节软骨及软骨下骨小梁较完整(×100) 图2实验组关节软骨表层脱落、碎裂，软骨下骨小梁坏死(×100) 图3对照组bFGFmRNA在软骨细胞中的表达较强(×100) 图4实验组bFGFmRNA在软骨细胞中的表达较弱(×100) 图5对照组bFGFmRNA在纤维细胞及血管内皮细胞中的表达较强(×100) 图6实验组bFGFmRNA在纤维细胞及血管内皮细胞中的表达较弱(×100) 图7对照组BMP-2 mRNA在软骨细胞及成骨细胞中表达较强(×100) 图8实验组BMP-2 mRNA在软骨细胞及成骨细胞中表达较弱(×100)
图9对照组BMP-2 mRNA在间质中表达较强(×100) 图10实验组BMP-2 mRNA在间质中表达较弱(×100)
3 讨论
本实验中作者发现实验组标本全部出现关节软骨塌陷，软骨下的死骨大都已经被肉芽组织所取代，虽然病程大都在1年以上，但很少能在坏死区见到新骨形成，仅个别病例在纤维组织中有软骨岛形成，充分说明在股骨头发生坏死后，其坏死区的骨修复过程极为缓慢，或基本处于停滞状态，表明NONFH发生后股骨头局部骨修复能力明显不足。
骨诱导、骨形成是由多种生长因子参与并调节的过程[4]，其中，bFGF和BMP是极为重要的生长因子。bFGF可促进骨和软骨细胞蛋白质的合成和分化增殖，加速新骨形成过程;同时bFGF也是一种强大的血管生长因子，可促进血管及新骨形成。bFGF在促进新生血管形成的同时，带来未分化的间充质细胞，从而增强BMP的诱导成骨能力[5、6]。BMP主要成骨作用是诱导间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞，具有高效诱导成骨活性[7]，其在体内诱导成骨的过程是软骨内成骨过程。研究[8～10]证实激素等致病因素对BMP-2及VEGF的表达有明显的抑制作用，由于其它促血管生成因子的血管生成作用是通过增强VEGF的表达及生成来实现的，VEGF可介导其他因子的作用，抑制 VEGF将阻断 bFGF的成血管活性[11]。由此可以推测股骨头坏死的主要致病因素对bFGF的表达也可能存在明显的抑制作用，其作用途径可能是通过上述致病因素对VEGF及BMP-2的表达抑制来实现的，而这一点有待进一步研究证实。本实验中观察到实验组bFGF及BMP-2的表达较对照组明显减弱，由此我们认为：bFGF与BMP-2在股骨头局部的表达减弱可能是股骨头在发生坏死后局部的骨诱导、骨修复能力不足的重要原因。在NONFH患者中，正是由于致病因素抑制了bFGF及BMP-2的表达，使得bFGF与BMP-2含量降低，最终影响到股骨头的自身修复。如果有方法可以拮抗致病因素的这种抑制作用，进而促进bFGF与BMP-2的表达，很可能有助于股骨头坏死的修复。
在股骨头缺血坏死中，往往由于其软骨下死骨被肉芽组织填充而载荷能力下降，最终软骨骨折致股骨头负重区塌陷。保留股骨头的治疗要求快速再血管化及重建骨小梁和软骨下骨，bFGF与BMP可以作为治疗因子辅助植骨材料通过刺激成骨、促进关节软骨修复、血管长入等多方面用于治疗股骨头坏死。目前已经有在动物实验中运用bFGF、BMP及VEGF等生长因子治疗股骨头缺血性坏死并取得良好疗效的研究报道[12～15]。由此，我们认为：临床中如果能在ONFH发病早期及时诊断，并通过应用介入、基因转染、手术等方法增加股骨头局部外源性bFGF与BMP-2的浓度，可能会增强股骨头局部自身的修复能力，在股骨头负重区软骨下坏死发生后短期内即由新生骨组织进行修复、替代，软骨下的机械强度得以加强，即可有效地预防软骨的塌陷，也许会成为一种有效的治疗方法。
有研究发现[17、18]，在骨的形成和修复过程中，bFGF与BMP-2的表达相互影响、相互促进，本实验中将bFGF与BMP-2表达的平均灰度值做直线相关检验后结果为正的直线相关，从而证实了这一理论。
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作者单位：1.宁夏回族自治区人民医院骨二科，银川 750021;2.宁夏医科大学，银川 750004