玻璃化法保存异体肌腱移植的组织学研究

【摘要】  ：［目的］对玻璃化法与程序冷冻法保存异体肌腱移植后的组织学演变及特性进行观察、分析，以了解其临床应用的可行性及影响因素。［方法］家兔36只，平均分为A组为新鲜自体肌腱移植组，B组为玻璃化法保存异体肌腱移植组，C组为程序冷冻法保存异体肌腱移植组，对术前、术后3、8、12周异体肌腱的形态学、组织学演变进行观察。［结果］玻璃化法保存肌腱完整率高于程序冷冻法，差异有显著性。A、B组移植后较C组粘连轻，光泽好。新生血管、腱细胞成熟早，愈合进程快。［结论］玻璃化法较好地保存了肌腱的细胞外结构，玻璃化法保存异体肌腱移植具有接近正常肌腱的组织学特性，其效果优于程序冷冻法。

关键词：

【关键词】  玻璃化　程序冷冻　肌腱　异体移植

　　Morphologic study on cryopreservation of tendoh allograft by vitrification

　　WU Fuzhang,BU Haifu,ZHAO Gang,et al.

　　Department of Orthopedics,Anhui Provincial Corps Hospital,Chinese People's Armed Police Force,Hefei,Anhui 230041,China

   　 Abstract：［Objective］To analyze the histological changes and mechanical characteristics after vitrification and slowfreeing method for tendon allograft.［Method］Thirtysix rabbits were divided into 3 groups: Group A  (fresh tendon autograft ),Group B(vitrified tendon allograft),Group C (slowfreezing tendon allograft).The morphologic changes of tenddonial grafts were observed microscopically and histologically at 0,3,8,and 12 weeks.［Result］Before transplantation,the integrated rate of Group B was 92.4%,which was significantly better than that of Group C (54.2%,P<0.01).Aftertransplantation,Group C was more heavy adhesion around tendon than that of Group A or B.In  Group A and B,new  collagen  fibers  and  significantly increased  and  reconstructed than that of Group C.［Conclusion］The tendon extracellular matrix could be preserved perfectly,and the tendon allograft can be preserved by vitrification.It is more applicable clinically than slowfreezing tendon allograft.

  　  Key words：vitrification;  slowfreezing;  tendon;  allograft

　　临床常用的程序低温冷冻法保存的异体肌腱是肌腱替代品的主要来源，但其操作费时复杂费用高，不可避免地会形成细胞内外大量冰晶，导致所保存的肌腱活性有限。新近出现的玻璃化法克服了上述缺点，其已在多细胞保存中获得成功，但对组织的保存则刚刚起步。国、内外对异体肌腱玻璃化法保存后的形态学、组织学特性研究尚无报道。本实验旨在研究玻璃化法保存肌腱的可行性和异体移植的有效性。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物

  　  新西兰兔60只，普通级(安徽医科大学动物实验中心)，体重（2.0±0.5）kg，雌雄不限。24只双侧跟腱作为移植材料，36只作为移植对象。

　　1.2 仪器和试剂
   
　　体视显微镜(奥林巴斯KWO-B，日本)、-80℃低温冰箱(Formascientific)，DCS-25T电子万能实验机(深圳新三思)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酰胺、丙二醇(PF)、程序冷冻仪(Linkam TMS94型)、37℃恒温水浴箱。

　　1.3 标本制作

   　 24只家兔以3％戊巴比妥钠2 ml／mg行耳缘静脉麻醉，无菌条件下切取双侧跟腱，长度约3～4 cm。冲洗后放入EC液中备用。

　　1.4  方法

　　1.4.1  玻璃化法保存 

　　上述肌腱在4℃条件下经3个梯度玻璃化液(主要由20％DMSO、2.5 mol/L乙酰胺、5％PF组成)平衡30 min后，直接投入液氮中保存2周以上。

　　1.4.2  程序冷冻法保存 

　　上述肌腱在4℃条件下浸入盛有程序冷冻液(主要由15％DMSO)冷存管中平衡30 min后放入程序冷冻仪，以2℃／min速度降温至-6℃植冰，平衡30 min后以0.5℃／min的速度降温至-50℃，平衡30 min后以1 ℃／min的速度至深低温-80℃，平衡60 min，投入液氮中保存2周以上。

　　1.4.3 肌腱移植 

　　移植分3组(每组12只家兔，双侧24条肌腱)，A组：新鲜自体肌腱移植组;B组：玻璃化法保存的异体移植组；C组：程序冷冻法保存的异体移植组；移植后分别于3、8、12周处死动物，每组每个时间点各取材6条肌腱观察。3％戊巴比妥钠2 ml／kg行兔耳缘静脉麻醉，随机选择实验侧。保留深部1股跟腱组织，切断浅部2股造成1.5 cm的缺损，选择相同长度及粗细的肌腱移植，8／0线行改良Kessler法吻合。对侧跟腱切断后原位吻合，作为自体对照。不作外固定。

　　1.4.4  形态组织学观察
 
　　(1)大体：观察肌腱的形态、色泽、弹性、韧性和完整程度；(2)光镜：HE染色，观察肌腱缝合点愈合情况，免疫反应程度，新血管长入，腱细胞、胶原(CF)成熟度。

　　1.4.5  统计学处理

　　肌腱完整率比较，采用x2检验。

　　2  结 果

　　2.1  移植前形态学、组织学观察

　　2.1.1  大体观察 

　　新鲜肌腱：兔跟腱为乳白色长索状组织，表面光滑，横截面为椭圆形，长径约1.5～2.5 mm，短径约0.5～1 mm，弹性韧性良好，所有肌腱均完整。

    玻璃化肌腱：大体形态同新鲜肌腱，弹性韧性良好，有断裂现象。玻璃化法保存肌腱完整率为92.64％；

    程序低温冷冻肌腱：肌腱为乳白色长索状组织，表面光洁度、弹性韧性稍差于新鲜肌腱，程序冷冻法保存的肌腱完整率为56.17％。

    　将玻璃化法和程序低温冷冻法保存的肌腱完整率进行比较，经x2检验，统计结果显示两者之间的差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.1.2  光镜观察 

　　新鲜肌腱：肌腱表面光滑，其内可见粗大的CF沿纵轴平行分布，排列规整，相互间有交叉，肌腱细胞数量少，沿CF周围纵向分布，排列呈串珠状，核呈椭圆形(图1)。
   
　　玻璃化肌腱：与新鲜肌腱的镜下结构基本一致，可见小部分CF断裂，CF间隙较新鲜组宽。肌腱细胞数量较新鲜组稍少(图2)。   
       
　　程序低温冷冻肌腱：肌腱表面光滑，粗大的CF沿纵轴平行分布，排列较新鲜组稍欠规整，相互间有交叉，但CF间隙较玻璃化腱组宽，CF断裂较多。肌腱细胞数量较新鲜腱、玻璃化腱组少，沿CF周围纵向分布，排列呈串珠状，核呈椭圆形(图3)。

　　2.2  移植后形态学、组织学观察

　　2.2.1 大体观察 

　　新鲜自体肌腱：3周时肌腱周围组织炎性反应轻，无明显充血、水肿，肌腱与周围组织间轻度粘连，粘连带主要集中在远近端吻合口处，肌腱完整易于分离，肌腱吻合部梭形膨大，吻合口已基本愈合;8周时肌腱周围组织无炎性反应，肌腱与周围组织间中度粘连，远近端吻合口处有较松的粘连带，肌腱完整与周围组织界线清楚，能够锐性分离，移植肌腱较正常肌腱韧性差。肌腱吻合部梭形膨大变小，吻合口愈合良好；12周时肌腱周围组织无炎性反应，与周围组织间轻度粘连，粘连较8周时减轻，移植肌腱中段表面较光滑，远近端吻合口处有松弛，吻合口部梭形膨大逐渐变小，移植肌腱与正常肌腱韧性相似(图4～6)。   
   
　　玻璃化异体肌腱：3周时肌腱周围组织炎性反应较轻，无明显充血、水肿，肌腱与周围组织间轻度粘连，粘连带主要集中在远近端吻合口处，肌腱完整易于分离，吻合部梭形膨大，吻合口已基本愈合；8周时肌腱周围组织无炎性反应，粘连中度，远近端吻合口处有较松弛的粘连带，肌腱能够锐性分离，移植肌腱较正常肌腱韧性差。吻合部梭形膨大变小；12周时肌腱周围组织无炎性反应，与周围组织间轻度粘连，粘连较8周时减轻，移植肌腱中段表面较光滑，远近端吻合口处有较松弛粘连带，吻合口部梭形膨大逐渐变小，吻合口愈合良好，移植肌腱与正常肌腱韧性相似(图4～6)。
     
　　程序冷冻异体肌腱：3周时肌腱周围组织炎性反应轻，无明显充血、水肿，肌腱与周围组织间轻度粘连，粘连带主要集中在远近端吻合口处，肌腱完整易于分离，吻合部梭形膨大，吻合口已基本愈合；8周时肌腱周围组织炎性反应较重，肌腱与周围组织间中度粘连，远近端吻合口处粘连最重，肌腱完整与周围组织界线欠清楚，但能够锐性分离，吻合口部梭形膨大，吻合口已愈合，移植肌腱较正常肌腱韧性差；12周时肌腱周围组织无炎性反应，与周围组织间中度粘连，粘连较8周时减轻，移植肌腱中段表面较光滑，远近端吻合口处有较致密的粘连带，吻合部梭形膨大逐渐变小，吻合口愈合良好，移植肌腱与正常肌腱韧性相似。3～8周时炎性反应较新鲜自体肌腱、玻璃化肌腱重(图4～6)。

   　 2.2.2  镜下观察     

　　新鲜自体肌腱：3周时移植肌腱吻合口处可见大量成纤维细胞与少量淋巴细胞填充，其内有较多血管浸入，细胞间有大量细CF，排列不规整，连接于吻合的肌腱间，缝线周围可见炎性细胞浸润；8周时移植肌腱吻合口处与周围粘连稍重，其间有大量血管浸入，细CF较3周时增多，细CF趋向于连接成束，成纤维细胞与淋巴细胞较3周时减少，缝线周围可见少量炎性细胞浸润。吻合口处表面光滑，其内仍有较多血管，细CF连结成束，粗大CF四周向中心逐渐替代细CF，淋巴细胞与炎性细胞消失。12周时移植肌腱部分的变化与8周相似，但胶原的替代进程稍快，吻合口处表面光滑，粗大CF与细CF相间排列，成纤维细胞数量减少，正大量演变成肌腱细胞，CF替代由肌腱端向吻合口中心进行(图7、10、13)。
       
　　玻璃化肌腱：3周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似，吻合口处可见大量成纤维细胞与少量淋巴细胞填充，其内有较多血管浸入，细胞间有大量细CF，排列不规整，连接于吻合的肌腱间，缝线周围可见炎性细胞浸润；8周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似，吻合口处与周围粘连较重，其间有大量血管浸入，细CF较3周时增多，细CF趋向于连接成束，成纤维细胞与淋巴细胞较3周时减少，缝线周围可见少量炎性细胞浸润。移植肌腱内肌腱细胞数目略少于新鲜自体肌腱，CF的替代过程稍慢；吻合口处表面较自体肌腱稍欠光滑，其内仍有较多血管，粗大CF四周向中心逐渐替代细CF，替代进程稍慢于自体肌腱，淋巴细胞与炎性细胞消失；12周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似，但胶原的替代进程稍慢于新鲜自体肌腱，吻合口处表面较光滑，粗大CF与细CF相间排列，成纤维细胞数量减少，正逐渐演变成肌腱细胞，CF替代由肌腱端向吻合口中心进行，但替代进程稍慢于新鲜自体肌腱(图8、11、14)。
       
　　程序冷冻肌腱：3周时移植肌腱部分与新鲜自体肌腱相似，吻合口处可见大量成纤维细胞与少量淋巴细胞填充，其内有较多血管浸入，其间有大量细CF与较致密的结缔组织，排列紊乱，连接于吻合的肌腱间，缝线周围可见炎性细胞浸润；8周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似，吻合口处与周围粘连较重，其间有大量血管浸入，细CF量较新鲜自体肌腱少，排列紊乱，成纤维细胞与淋巴细胞较3周时减少，缝线周围可见少量炎性细胞浸润；肌腱内细胞数目接近正常肌腱，部分细胞核形态介于肌腱细胞与成纤维细胞之间，正常肌腱细胞少于玻璃化肌腱组，CF较玻璃化肌腱细小，排列欠规整，CF未完全连结成束，CF间交联密集；吻合口处表面欠光滑，细CF趋于连结成束，较粗大CF由四周向中心逐渐替代细CF与结缔组织，但替代进程落后于玻璃化肌腱，成纤维细胞逐渐演变成肌腱细胞：12周时移植肌腱部分的变化与玻璃化肌腱相似，但演变进程稍慢于玻璃化肌腱，吻合口处仍有较多血管浸入，粗大CF与细CF相间排列，成纤维细胞数量减少，正逐渐演变成肌腱细胞，CF替代由肌腱端向吻合口中心进行，但替代进程稍慢于新鲜自体肌腱和玻璃化异体肌腱(图9、12、15)。

  　  3 讨 论
     
　　玻璃化法又称为无冰晶技术。其本质是液体在冷冻过程中，连续地固化形成无完形的玻璃体，达到高度黏稠状态，而其内部无晶体或仅少量结晶形成。玻璃化技术采用高浓度冷冻保护剂(CPA)和单步快速降温，可以同时防止细胞内、外冰晶的形成，其实质是细胞内、外玻璃化，因而可以避免冰晶所造成的挤压损伤和冻融效应［1］。
     
　　程序冷冻法采用低浓度CPA，先使样品缓慢降温，细胞外水结冰，导致细胞外CPA浓度升高，细胞脱水，细胞内CPA浓度随之升高，然后将样品没入液氮进行快速降温，以减少细胞内冰晶的形成，其实质是细胞内玻璃化。但必将形成大量的细胞外冰晶，对细胞造成致命伤害。冷冻过程复杂，影响因素较多。

  　  本实验中，经玻璃化法和程序冷冻法保存的肌腱具有与新鲜肌腱相似的形状、色泽、弹性和韧性。镜下观察玻璃化法较程序冷冻能够更好保存肌腱的形态结构，玻璃化腱完整率远高于程序冷冻腱，与新鲜肌腱的显微结构无明显差异。Kuleshova通过比较细胞活性，认为玻璃化法优于程序冷冻法［2］。玻璃化腱内细胞虽然有损伤现象，但是较程序冷冻腱损伤要轻，尤其是细胞外基质获得较好的保存。贾晓明证实：组织内部细胞间连接以及细胞与细胞外基质的连接对组织冷冻损伤有重要影响，其存在直接影响细胞的活力［3］。Jomha观察到低浓度CPA中基质含量明显低于高浓度CPA中基质含量，而且基质结构破坏更严重［4］。自体移植组肌腱细胞活性、胶原结构保存最好，无免疫排斥，在移植后早期能够继续分泌胶原蛋白，积极参与肌腱的修复重建，因此，移植后肌腱细胞与CF修复重建快，吻合口部的愈合好、粘连较轻，功能恢复好。玻璃化肌腱在冷冻保存过程中，肌腱细胞活性得以良好保存的同时，肌腱细胞外基质及胶原结构损伤也较轻微，因此，移植后肌腱细胞在早期能够继续分泌胶原蛋白，参与肌腱的修复重建，同时良好的细胞外基质及胶原结构，为随后肌腱细胞与胶原的替代提供良好生长支架，使降解与替代重建同步进行，肌腱修复效果与新鲜自体肌腱相似，但修复重建时间较自体组稍长。程序冷冻肌腱在保存过程中，肌腱细胞虽有部分保留，但细胞外基质及胶原结构损伤较重，移植后肌腱细胞与胶原修复重建时间延长，肌腱粘连较重，肌腱移植效果较玻璃化肌腱差。

   　 肌腱移植后吻合口部的愈合与粘连情况，直接影响术后的效果。Pegg认为：组织是细胞和细胞间连接组合在一起的功能整体，程序冷冻法对组织整体结构损伤较大，细胞外基质损伤严重，细胞不能发挥各自作用，导致肌腱移植后效果不好［5］。程序冷冻这种有明显创伤的处理使腱抗张强度显著降低，且因腱细胞失活不能产生内源性愈合过程，完全依赖于外源性愈合，易产生严重粘连［6］，远未达到异体移植的理想要求［7］。新鲜自体肌腱移植后3周时，吻合口部内由大量成纤维细胞及其分泌的细CF填充，8周时成纤维细胞减少，细CF趋向于连接成束，部分细CF连结成束，由四周向中心逐渐替代细CF，成纤维细胞逐渐演变成肌腱细胞，12周时粗大CF与细CF相间排列，CF替代仍在继续。玻璃化异体肌腱吻合口部的愈合与胶原的替代时间较自体肌腱稍晚，进程也较慢，局部粘连也稍重，替代后的CF排列也较自体组欠规整。而程序冷冻肌腱的替代过程较新鲜组与玻璃化组更慢，局部粘连也更重，替代后的胶原结构也更差。通过3组肌腱移植后愈合进程的动态观察与比较，可以看出新鲜自体肌腱移植效果优于玻璃化异体肌腱，而玻璃化异体肌腱又优于程序冷冻异体肌腱。

【参考文献】
  　　［1］Duquesnoy RJ，李幼平，主编.移植免疫生物学［M］．北京：科学出版社，2000，141-153．

　　［2］ Kuleshova LL，Lopata A．Vitrification can be more favorable than slow cooling［J］．Fertile Sterile，2002，3：449-454．

　　［3］贾晓明，纪晓峰，Yang H，等．细胞连接对组织冷冻损伤的作用［J］.中华外科杂志，2001，12：954-957.

　　［4］Jomha NM，Anoop PC，Mcgann LE．Intramatrix events during cryopreservation of porcine articular cartilage using rapid cooling［J］．J Orthop Res，2004，1：152-157.

　　［5］Pegg DE．The current status of tissue cryopreservation［J］．CryoLetters，2001，2：105-112．

　　［6］徐红立，王爱民．肌腱愈合早期血管内皮生长因子及其受体的表达［J］．中国矫形外科杂志,2004，12：842-844.

　　［7］唐林俊，程国良，方光荣，等．反复冻融及超深低温处理的异体肌腱移植实验研究［J］． 中国修复重建外科杂志，1998，4：241-244．

作者单位：1.武警安徽省总队医院骨科，合肥 230041；2.安徽医科大学第一附属医院骨科， 合肥 230041；3.中国科学技术大学低温生物力学实验室，合肥 230041；基金项目：国家自然科学基金（编号：50506029）和安徽省自然科学基金（编号：070413099）资助