细胞因子表达谱在人脐带Wharton胶间质干细胞诱导分化成软骨细胞的变化

【摘要】  ［目的］观察从人脐带Wharton’s胶中分离的间质干细胞(WMSC)诱导分化成软骨细胞时表达细胞因子及生长因子的异同，从而为WMSC诱导的软骨细胞用于组织工程的构建以及其在临床的应用打下基础。［方法］从人正常足月分娩的脐带中分离间质干细胞，在体外以条件培基诱导分化成软骨细胞，免疫组化法鉴定其特性，应用细胞因子蛋白芯片方法检测WMSC及其诱导分化的软骨细胞所表达细胞因子及生长因子，并取成年人正常关节软骨为对照。［结果］78种细胞因子和生长因子在WMSC及其诱导分化的软骨细胞均有表达，两者表达谱相同，而表达量则多少有不同。诱导分化后表达量增多的因子为：MIP-3α，ENA-78，VEGF，PDGF-BB，SCF，FGF-7，GCP-2及SDF-1。减少的因子为MIP-1βHGF，NT-4，IL-10及MIP-δ。其共同表达的具免疫抑制作用的因子对降低异体移植时的免疫排斥可能有一定作用，其共同表达的金属蛋白酶抑制因子对其移植于体内时可具有保护作用。而共同表达的肿瘤生长抑制因子则可减少对干细胞移植后瘤变的担心。［结论］从人脐带wharton’s胶中分离的间质干细胞(WMSC)诱导分化成软骨细胞时表达细胞因子及生长因子谱相同，是一种理想的可替代自身软骨细胞的新型种子细胞，用于构建工程软骨组织。

【关键词】  干细胞　软骨细胞　细胞因子　生长因子　蛋白芯片法

　　Changes of cytokine profile during the differentiation from human umbilicord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells to cartilage cells

　　HOU Ke-dong, GUO Quan-yi,ZHANG Li , et al.

　　Orthopedic Research Institute，General Hospital of PLA,Beijing  100853 China
  
　　Abstract: ［Objective］To study cytokine and growth factor expression patterns of chondrocytes differentiated from mesenchymal cells isolated from human umbilical cord Wharton’s jelly and of normal adult articular chondrocytes. ［Methods］Fresh umbilical cord were collected from healthy donor full-term births.Mesenchymal stem cells were isolated from Wharton’s jelly of two human unbilical cords and cultured in conditional medium to differentiate to cartilage cells. Immunochemical staining method was used to identify the cartilage cell phenotype. Normal adult articular cartilage cells were isolated from one donor. Cytokine antibody-array technology (Clontech) was used to analyze cytokines and growth factors.［Results］The cytokine and growth factor profiles of chondrocytes differentiated from WMSC(Wharton jelly MSC) and normal cartilage cells were similar, but the expression level was somewhat different. The maximum expression in chondrocyte were:MIP-3α, ENA-78, VEGF, PDGF-BB, SCF, FGF-7, GCP-2  and SDF-1. The decreased factors were :MIP-Iβ,HGF, NT-4, IL-10 and MIP-δ.A range of soluble immune tolerant factors IL-10, TGF, VEGF and HGF were expressed in significant amount, thus creating a local immunosuppressive environment. This result suggests that those factors may contribute to the ability of WMSC to avoid allorejection. WMSC and derived cartilage cell can produce oncostatin M and LIGHT, and high level of TIMP-1 and TIMP-2, which may help for prevent malignant change and enzyme digestion in vivo during transplantation.［Conclusion］These findings should encourage the use of mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly of human umbilical cord as a potential new seed cells in cartilage tissue engineering.

  　  Key  words：stem cells；chondrocyte；cytokines；growth factors；protein antibody array
   
　　干细胞应用于再生医学已从研究进入了临床应用，应用的主要是骨髓干细胞。干细胞应用于关节软骨的修复重建，除自体关节软骨细胞外，也主要是从骨髓中分离间质干细胞［1、2］，并有初步的临床应用报告，然而，异体骨髓干细胞的来源有限，且免疫配型不完全符合将导致免疫排斥和治疗失败，自体骨髓中干细胞随着年龄的增长而减少，且取材时有轻度创伤，为克服这些缺点，寻找更理想的新的干细胞来源是所需要的。

　    从人脐带Wharton’s胶中分离干细胞是一种新的尝试，最早由McElreavey KD等在1991年发现人脐带中存在纤维母细胞样细胞，其后又有进一步的研究报告证实了间质干细胞的存在［3］。我们的研究也表明人脐带Wharton’s胶干细胞(Wharton’s jelly mesenchymal stem cells，WMSC)具有前软骨细胞的特性，表现在它表达Ⅱ型胶原和SOX-9基因，并可在生物反应器培养中形成类软骨组织［4］，本研究是进一步探讨从WMSC在体外诱导分化成软骨细胞时可能产生的分子变化，采用蛋白抗体芯片方法对79种细胞因子及生长因子进行观察和对比，为应用人脐带Wharton胶间质干细胞诱导产生的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的优缺点及临床应用时的参考。

   　 1  材料与方法

   　 取新鲜足月顺产胎儿的脐带两条，命名WSC-1，WSC-2，小心分离脐带血管组织和脐带外膜组织，即可获得脐带Wharton胶；采用胶原酶消化法，快速获得大量成纤维细胞样形态的干细胞，脐带Wharton胶干细胞原代培养时间约为3～5 d，CFU-F频率约为3∶104，流式细胞仪检测脐带Wharton胶干细胞阳性表达CD44、CD105、CD271，而不含表达CD34、CD45造血干细胞标志，详细方法同前。

  　  WMSC-1，WMSC-2均向软骨诱导分化，按照以下培养体系和培养条件进行：培养体系为：DMEM(20%FBS)加入10 ng／ml hTGF-β1，10 ng／ml hFGF，体积分数为1%ITS和1.0×10-8 mol／L地塞米松；培养条件：培养温度为37℃、在5%CO2的培养箱内进行培养，每3 d换液。软骨细胞的鉴定方法同前。分别命名为WSCC-1，WSCC-2。WSCC-1，WSCC-2的免疫组化鉴定方法及RT-PCR方法见前［4］。
   
　　上述4株细胞扩增至107，开始进行蛋白芯片细胞因子检测，采用康成公司RayBio人细胞因子抗体芯片，共79种，其中属于白细胞因子(interleukine)17种，趋化因子(chemokine)28种，生长因子10种，骨软骨血管相关因子6种，免疫调节因子4种，此外还有酶抑制因子，肿瘤生长抑制因子等；具体操作步骤如下：

　　1.1  蛋白质抽提及BCA法蛋白质定量，按康成试剂盒进行。

　　1.2  细胞因子检测

　　1.2.1  试剂 

　　从康成公司购买RayBio人细胞因子抗体芯片试剂盒

　　1.2.2  仪器 

　　脱色摇床(兴化仪器厂)，扫描仪(Uniscan D1000清华紫光股份有限公司)，图像分析软件：scanAlyze

　　1.2.3  操作步骤

　　1.2.3.1  封闭和孵育

  　  (1)将膜放入反应盒(“-”表示抗体包被面)。

   　 (2)加入2 ml 1x封闭缓冲液，室温孵育30 min。

   　 (3)去除封闭缓冲液，加入1 ml样品室温孵育1～2 h。(事先用1x封闭缓冲液稀释样品裂解液使其1 ml的蛋白含量在50～500 ug之间。)

    　(4)去除样品溶液，1x洗液I洗膜3次。每次加入2 ml 1x洗液I室温洗膜5 min。20x洗液I用双蒸水稀释。

   　 (5)1x洗液Ⅱ洗膜2次。每次加入2 m1 1x洗液Ⅱ室温洗膜5 min。重复1次。20 x洗液Ⅱ用双蒸水稀释。

   　 (6)准备一抗工作液。加100 ul 1x封闭液至生物素标记抗体管中。轻轻混匀并将混合液转移到装有2 ml 1x封闭液的管中。

  　  (7)每张膜加入1 ml已稀释的生物素标记抗体。室温孵育1～2 h。

  　  (8)洗膜。重复上述4、5步骤。

 　   (9)每张膜加入2 ml 1 000倍稀释的HRP标记的抗链霉生物素抗体。(如取2 ul 1 000xHRP标记的抗链霉生物素抗体加到1 998 ul 1x封闭缓冲液中)

   　 (10)室温孵育2 h。

    　(11)洗膜。重复上述4、5步骤。

　　1.2.3.2  检测 

　　检测反应完成后，将膜夹在两塑料薄膜之间，去除膜上过量检测试剂，X线胶片曝光。X-射线胶片曝光后，将胶片上的图像用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为Microsoft Excel文件。

    　2  结果

　　2.1  间质干细胞鉴定
   
　　经流式细胞仪分析表明，WMSC不表达造血干细胞标志(CD34及CD4）而表达黏附分子和间质细胞标志(CD44、CD105、CD271）；HLA-ABC阳性表达，HLA-DPDQDR阴性表达，与骨髓、脂肪等间质干细胞特点相同。
  
　　不同代人脐带Wharton胶MSCs以低密度接种到6孔板10 d后，形成散在分布的集落，集落大小形态各不相同，细胞呈旋涡状分布。人脐带Wharton胶WMSCs第2代集落形成率为(0.3 000±0.0 392)、4代(0.2 975±0.0 378)和8代(0.2 800±0.0 316)，不同代间集落形成率差异无统计学意义(P>0.05)。有限稀释法检测CFU-F形成数，显示随着细胞接种密度的增加，克隆数也随之增加。

　　2.2  诱导软骨细胞的鉴定

　　2.2.1  向软骨细胞诱导培养后密集的细胞胞内、胞外番红“0”染色强阳性(图1a)；

　　2.2.2  甲苯胺蓝染色显示氨基多糖 

　　见细胞周围呈蓝色(图1b)；

　　2.2.3  Ⅱ型胶原免疫组织化学染色(图1c)，大多数细胞内外基质均有棕色着色，RT-PCR分析，表明Ⅱ型胶原及SOX-9均为阳性(图1d)。

　　2.3  细胞因子检测

　　2.3.1  细胞因子在间质干细胞(WMSC)的表达
 
　　79种细胞因子除IL-13表达痕量外，其他均表达，两株平均量表达最高(OD值>0.800)的依次是IL-8、GRO、IL-6、IL-1β、IL-1α和GRO-α（图4～7）。WMSC-1与WMSC-2两株表达类似，只少部分表达量有差异(OD值相差大于1.5倍)，它们是趋化因子：IGFBP-3，IGFBP-4，Eotaxin-2，及IL-5，IL-7等。

　　2.3.2  细胞因子在间质干细胞诱导软骨细胞的表达 

　　79种细胞因子在诱导软骨细胞的表达谱与间质干细胞相同，两株平均量表达最高(OD值>0.800)的依次是GRO、IL-8、IL-6、IL-1β、TIMP-1、GRO-α和MIP-3α。WMSCC-1与WMSCC-2两者也类似，表达量有差异的也为趋化因子：Eotaxin，Eotaxin-2，IP-10，NAP-2，GCP-2等，还有生长因子FGF-6，FGF-7，HGF，细胞因子TNF等。

　　2.3.3  干细胞与诱导软骨细胞的差别 

　　两者相同点是79种因子的表达谱完全相同，诱导过程中没有缺失，也没有新增。两者不同点是部分因子表达水平有增减，干细胞诱导成软骨细胞后细胞因子降低的有5种，依次为：(WMSCC／WMSC)巨噬细胞炎症因子MIP-1β：0.63，HGF：0.62，NT-4：0.55，IL-10：0.37，MIP-δ：0.35；干细胞诱导成软骨细胞后细胞因子升高，且大于1.5倍的有8种，依次为：MIP-3α：4.52，ENA-78：2.2，VEGF：2.09，PDGF-BB：1.68，SCF：1.66，FGF-7：1.64，GCP-2：1.61，SDF-1：1.54。均为趋化因子及生长因子。

　　2.3.4  具有免疫抑制功能的细胞因子在两类细胞中表达比较(图2)。

　　2.3.5  其他因子的表达
   
　　肿瘤生长抑制因子oncostatin M及基因LIGHT的可溶性蛋白在WMSC及WMSCC均有表达，文献尚未见报道。

   　 脑生长因子(brian derived phosphotrophine)BDNF，神经生长素(neurotrophine)NT-3，NT-4及胶质细胞衍生神经生长因子(glial cell derived neurotrophic factor)GDNF在WMSC及WMSCC均有较高的表达，因此，有利于向神经细胞诱导分化。

    　蛋白酶抑制因子TIMP-1，TIMP-2有较高的表达，因此推测其在异体内生长时可防止蛋白酶的侵袭和消化。

　　2.3.6  诱导软骨细胞与正常软骨的比较  两者细胞因子表达谱也是相同的，但诱导的软骨细胞表达因子多高于正常软骨细胞1.5倍，如：IL-1、IL-6,IL-8，MIP-3，VEGF，IL-1α，ENA及趋化因子GRO，诱导的软骨细胞表达因子低于正常软骨细胞的为：HGF。

 　   3  讨论
   
　　应用蛋白抗体芯片法系统观察了细胞因子及生长因子在人脐带Wharton胶中间质干细胞的表达，包括趋化细胞因子、各类细胞生长因子、白介素等共79种，大大扩展了文献的报道［5］，文献中多用基因芯片研究，涉及到部分细胞因子，如Rodrigo A等比较了脐带静脉间质干细胞与骨髓干细胞基因表达的异同，Weiss ML等曾有报道UC-MSC可分泌血管生长因子(VEGF)和生长因子，如FGF，GDNF(glial-cell derived neurotropic factor)，尚无细胞因子蛋白芯片的专题报道。本文是进一步观察Wharton胶中间质干细胞在体外诱导分化成软骨细胞时可能发生的变化，结果表明其表达的细胞因子谱是完全相同的，而少数因子表达量有所上调或下调。对干细胞诱导分化成软骨细胞时细胞因子的变化文献只有对少数因子的报道，Djouad F等应用RT-PCR分析384种mRNA，表明多种趋化因子的存在，与作者的结果相同，而Lisignoli G报道间质细胞衍生蛋白SDF-1在分化时下调(1例)，而作者的结果是上调，但都例数太少，有待进一步观察。
   
　　IL-10，TGF，VEGF，HGF都只有免疫抑制作用，已表明它们表达于骨髓干细胞，特别值得注意的是这些免疫抑制因子在WMSC及WMSCC两种细胞也均有表达，只是表达量或多或少，当WMSC及WMSCC应用于异体移植时，它对免疫排斥抑制的作用有待进一步观察。

  　  本研究结果表明，Wharton胶间质干细胞及其诱导的软骨细胞均表达肿瘤抑制因子，因此，在体内瘤变的可能性小；此外，它们表达的巨噬细胞移动抑制因子和蛋白酶抑制因子也有利于防止炎症的产生和对软骨细胞的破坏；有报道将人脐带间质干细胞应用于大鼠帕金森氏病的治疗，结果表明不产生肿瘤，不诱发免疫排斥，不产生异常神经症状，进一步展示了脐带间质干细胞具有很好的应用前景。

  　  本研究结果表明，Wharton胶间质干细胞诱导成软骨细胞后与正常软骨细胞表达的因子谱也是相同的，只是少数细胞因子表达量有一定差异，这对其生物特性有何影响有待进一步观察。

【参考文献】
  　　［1］宋世锋，肖海涛，武伟，等.骨髓干细胞体外组织工程软骨形成的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2009，6：462-465.

　　［2］叶成，史鹏.骨髓间充质干细胞与成骨［J］.中国矫形外科杂志，2005，5：389-392.

　　［3］Sarugaser R, Lickorish D, Baksh D，et al.Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells：a source of mesenchymal progenitors［J］. Stem Cell，2006，23:220-229.

　　［4］侯克东，许文静，张莉，等.人脐带Wharton胶间质干细胞向软骨细胞诱导的实验研究［J］.中华骨科杂志，2007，12：930-935.

　　［5］侯克东，卢世璧，张莉，等.人脐带Whaaon胶间质干细胞的分离，培养与鉴定［J］.解放军医学，2008，4：369-373.

作者单位：解放军总医院全军骨科研究所，北京 100853；　　国家自然科学基金资助项目（编号：30672134）；国家科技部“863”计划项目（编号：2007AA021902）；国家支撑计划项目（2006 BAI16B04）