吡咯喹啉醌对雪旺细胞增殖及NF-κB表达的影响

【摘要】  ［目的］观察吡咯喹啉醌对雪旺细胞的增殖作用及其对体外培养雪旺细胞NF-κB表达的影响。［方法］新生鼠雪旺细胞体外原代培养及纯化，S-100免疫荧光标记鉴定雪旺细胞，设实验组与对照组，实验组吡咯喹啉醌的浓度为100 nmol／L；加药72 h后提取总mRNA及总蛋白进行RT-PCR和Western blot分析。［结果］采用RT-PCR和Western blot检测NF-κB的表达，结果均表明实验组表达较对照组高(P<0.05)。［结论］吡咯喹啉醌可促进雪旺细胞增殖，NF-κB上调在吡咯喹啉醌促雪旺细胞增殖中起作用。

【关键词】  吡咯喹啉醌　雪旺细胞　增殖　NF-κB

　　 Effects of pyrroloquinoline quinone on proliferation and expression of NF-κB in cultured Schwann cells

　　HE Bin, LIU Shi-qing, LI Hao-huan.

　　Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
   
　　Abstract: ［Objective］To investigate the effects of pyrroloquinoline quinine (PQQ) on proliferation and expression of NF-κB of Schwann cells. ［Methods］Schwann cells were cultured from sciatic nerves of SD rats in vitro. The Schwann cells were identified and purified by immunofluorescence of S-100 and Ara-C. Experimental group with was 100 nmol/L of PQQ and control group were set up.The expression of NF-κB in Schwann cells was determined by RT-PCR and Western blotting.［Results］The expression of NF-κB were up-ragulated by PQQ in cultured Schwann cells (P<0.05).［Conclusion］PQQ could promote the proliferation of Schwann cells and up-regulation of NF-rd3 play an important role in this process.

   　 Key  words：pyrroloquinoline quinone;  Schwann cell;  proliferation;  NF-κB
   
　　雪旺细胞(schwann cells，SCs)是周围神经系统的主要胶质细胞，在周围神经损伤、再生和修复过程中发挥重要作用［1］。目前神经再生工程研究飞速发展，SCs作为该领域的种子细胞日益为研究者所重视［2、3］。SCs体外增殖速度缓慢，体外短时间内扩增大量高纯度SCs是神经再生组织工程领域研究的热点。吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种不依赖于NAD(P)和FAD的葡萄糖脱氢酶辅基，在生物体内可发挥多种生物学效应，能促进动物的生长发育，细胞的增殖，保护神经细胞并促进其神经生长因子的分泌［4］。先前已有学者将PQQ作用于损伤的周围神经，发现它可以促进周围神经修复及再生［5～7］；而且发现PQQ可以促进SCs分泌生长因子［8、9］；得到了PQQ促进体外培养SCs增殖的最佳作用浓度和最佳作用时间［10］。本实验旨在研究PQQ促进体外培养SCs的增殖并观察其对体外培养SCs的NF-κB表达的影响，进一步探讨PQQ促进SCs增殖效应并揭示其可能的机制。

　    1  材料与方法

　　1.1  材料

  　  出生3～5 d SD大鼠20只(武汉大学医学部实验动物中心提供)：DMEM／F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)；6孔板(Corning公司)；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)；Trizol、PCR引物(Invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(Fermentas公司)；蛋白裂解液(碧云天公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱公司)；兔抗NF-κB一抗、羊抗兔二抗(Santa Cruz公司)。

　　1.2  雪旺细胞体外培养及纯化

 　   取3～5 d SD大鼠，显微镜下无菌剥离双侧坐骨神经；D-Hanks液漂洗后移入混合酶(含0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅱ型胶原酶)中，于37℃空气摇床中消化40 min；1 000 r/min离心10 min，弃上清后加入5 ml培养液(含10%胎牛血清)，将细胞悬液移入培养瓶中，置于37℃，含5%CO2培养箱中培养；30 min后行差速贴壁去除成纤维细胞，于次日加入阿糖胞苷(Ara-C，10-5 mmol／L)继续杀灭成纤维细胞，换液继续培养。

　　1.3  S-100免疫荧光鉴定雪旺细胞

   　 将培养的细胞PBS洗涤3次×5 min；4℃、4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次×5 min；加1%triton-100，37℃孵育20 min，PBS洗涤1次×5 min，正常羊血清封闭5 min，PBS洗涤1次×5 min；加兔抗大鼠S-100抗体4℃过夜；PBS洗涤3次×5 mini加羊抗兔IgG-FITC，37℃避光孵育30 min，PBS洗涤3次×5 min。

　　1.4  实验分组

   　 选择细胞密度和生长状况相同的两孔细胞分别作为实验组和对照组，每组做三次重复实验：在该课题组先前的研究中我们已经得到PQQ促进SCs增殖的最佳浓度为100 nmol／L，以及最佳作用时间为72 h［10］，因此本实验中采用最佳PQQ作用浓度100 nmol／L为实验组，对照组加入等量PBS。置于37℃含5%CO2的培养箱中培养，提取RNA及蛋白进行相关检测。

　　1.5  RT-PCR检测

   　 加入PQQ培养72 h后用Trizol试剂法提取总RNA，采用两步法RT-PCR进行目的基因片段扩增。NF-κB上游引物序列5’-CTGATGTGCACCGACAAGTGG-3’，下游引物序列5’-GTTGATGGTGCTCAGGGATGAC-3’，预期扩增产物片段大小353bp。β-actin上游引物序列5’-CCTGACCGAGCGTGGCTACAGC-3’，下游引物序列5’-AGCCTCAGGGCATCGGAAC-3’，预期扩增产物片段大小205 bp。反应条件：94℃预变性10 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s(NF-κB)／55℃ 30 s(β-actin)、72℃30 s，进行30个循环；再以72℃延长10 min。取产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像扫描系统分析。

　　1.6  Western blot检测

  　  将实验组和对照组细胞用预冷PBS洗3遍，然后每孔细胞加入裂解缓冲液100 ul，冰上裂解10 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清进行BCA蛋白定量，取样品进行SDS-PAGE电泳，样品分离后转移至PVDF膜。转印后加入含5%脱脂奶粉的PBS-T缓冲液中封闭1 h，加入兔抗NF-κB一抗(1∶500)，4℃过夜，PBS-T漂洗；然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(山羊抗兔)，室温孵育1 h，PBS-T漂洗后，加入ECL化学发光剂发光，柯达胶片曝光，凝胶成像系统扫描分析。

　　1.7  统计学分析

    　结果以均数±标准差(x-±s)表示，应用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

 　   2  结果

　　2.1  雪旺细胞形态学观察

    　根据Theodor于1939年首次对雪旺细胞进行的报道，该细胞在光镜下呈梭形、体积小；有两极、胞核明显、呈卵圆形［11］。本实验中的雪旺细胞与先前学者描述的相同，大多成梭形，两端有两个突起，细胞数较少处多呈尖对尖或并排排列，较多处则成簇状排列(图1)。

　　2.2  雪旺细胞S-100蛋白免疫荧光标记

    　雪旺细胞经S-100免疫荧光标记鉴定，荧光显微镜下观察S-100荧光标记阳性细胞并计数，胞浆呈绿色荧光者为阳性，SCs纯度达90%以上（图2)。

　　2.3  PQQ对雪旺细胞形态学影响

   　 在本实验中加入浓度为100 nmol／L的PQQ培养72 h，从下图的细胞长势可见PQQ组细胞密度及长势均比对照组要好(图3)。PQQ促进SCs增殖主要是刺激SCs进入S期，缩短细胞从Gl期进入S期的时间，使分裂相的SCs明显增多，进而促进其增殖。

　　2.4  RT-PCR检测mRNA表达

  　  使用RT-PCR技术分别对PQQ组和对照组NF-κB的mRNA表达进行分析，结果表明PQQ组的NF-κB的mRNA表达较对照组高(P<0.05)，即100 nmol／PQQ可以促进SCs中NF-κB基因表达增高(图4)。

　　2.5  Western blot检测蛋白表达

 　   对PQQ组和实验组NF-κB分别进行Western blot检测，分析结果表明PQQ组的NF-κB蛋白表达高于对照组(P<0.05)；即浓度为100 nmol／L的PQQ可以使SCs中NF-κB蛋白的表达上调(图5)。3  讨论
   
　　PQQ是近些年来研究较多的新型维生素，其作用机制可能与维生素和多肽类细胞因子这两类因子的作用机制相似。PQQ作为醌蛋白酶的辅基在生物新陈代谢的氧化还原过程中传递电子，提供生长所需能量；调节体内脂肪、碳水化合物、蛋白质和核酸代谢；刺激合成辅酶Q，加强自由基的清除能力，增强细胞对过氧化氢、黄曲霉素等的抗损伤能力。PQQ对SCs的增殖可能有两方面的刺激作用：一是PQQ作为细胞能量代谢的重要辅基和必需的生长因子，增强细胞的代谢，改善细胞的活力促进神经生长因子的表达；二是PQQ能缩短生物生长的迟缓期，改变细胞周期进程，刺激细胞从静止期Go进入活跃的S期，增加G2/M期细胞的数量。
   
　　NF-κB是近年研究较热的一个基因转录调控蛋白，它广泛地参与细胞生长、分化、免疫和炎症反应，产生抗凋亡、促增殖的作用，是细胞重要的信号传递通路，可通过调节一系列基因转录、表达而发挥其抗凋亡作用。NF-κB是由两种Rel家族蛋白构成的二聚体蛋白质，其中p65／p50异源二聚体是NF-κB的典型代表，p50含核定位信号，与DNA直接结合；p65含转录活化区域，参与基因转录的起始调节，具有转录激活功能。静息状态下，NF-κB以非活性状态存在于细胞质中，不具有调节基因转录能力。当细胞受到细胞因子等与细胞分裂增殖有关的因素等刺激时，NF-κB可被活化，活化的NF-κB进入胞核与核内DNA特定序列结合，调节相应基因的转录，促进细胞增殖［12］。近年有学者研究表明雪旺细胞中NF-κB表达增高可以促进轴突向外生长［13］。

　　本课题组先前已对PQQ促进SCs增殖做了一些初步的研究，MTT法证实PQQ确实可以促进SCs的增殖，并且得到了PQQ促SCs增殖的最佳浓度为100 nmol／L，最佳作用时间为72 h［10］；另外作者还用Western blot法检测了PQQ作用下SCs内PCNA(增殖细胞核抗原)的表达情况，研究结果表明PQQ可明显上调SCs内PCNA的表达，且在PQQ浓度为100 nmol／L时表达最高。基于先前研究结果已经表明PQQ终浓度为100 nmol／L对SCs的增殖作用最佳，因此在本实验中作者采用PQQ终浓度为100 nmol／L作为实验组进行研究，对照组为等量PBS，本实验研究结果表明PQQ可以促进体外培养SCs的NF-κB表达上调，且在mRNA水平及蛋白水平均有上调表达的作用，使NF-κB的mRNA和蛋白分别上调了47%与32%，表明PQQ可以增加SCs内NF-κB的表达，而且NF-κB表达上调在PQQ促进SCs增殖的过程中起了一定的作用。综上所述，该研究表明PQQ可以促进SCs增殖，且NF-κB表达上调在该过程中起作用，这一研究结果说明PQQ可以作为体外SCs培养的刺激剂，这就为体外迅速培养大量雪旺细胞提供了新的思路和理论依据，以及为今后的周围神经组织工程的基础研究及日后临床应用做贡献。

【参考文献】
  　　［1］Bergey PD, Axel L. Focal hypertrophic cardiomyopathy simulating a mass: MR tagging for correct diagnosis［J］. AJR Am J Roentgenol，2000,1:242-244.

　　［2］程飚，李伯休，陈峥嵘.雪旺细胞构建人工神经在大鼠长段神经缺损中的修复作用研究［J］.中国矫形外科杂志，2007，15：1562-1565.

　　［3］黄明，罗卓荆，肖伟，等.免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2008，16：599-612.

　　［4］Matsushita K, Toyama H, Yamada M,et al.Quinoproteins: structure, function, and biotechnological applications［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2002,1:13-22.

　　［5］李皓桓，刘世清，彭昊.吡咯喹啉醌对损伤周围神经的促恢复作用［J］.武汉大学学报(医学版)，2004,25：157-158.

　　［6］刘世清，李皓桓，彭昊，等.吡咯喹啉醌充填导管诱导外周神经再生的实验研究［J］.中华显微外科杂志，2005，28：145-147.

　　［7］李皓桓，刘世清，彭昊，等.吡咯喹啉醌对离断周围神经的促再生作用［J］.武汉大学学报(医学版)，2006,27：495-497.

　　［8］李皓桓，刘世清，彭昊，等.吡咯喹啉醌对许旺细胞合成与分泌神经生长因子的影响［J］.中华显微外科杂志，2005，28：242-243.

　　［9］Liu S, Li H, Ou Yang J,et al.Enhanced rat sciatic nerve regeneration through silicon tubes filled with pyrroloquinoline quinine［J］. J Microsurgery, 2005,25:329-337.

　　［10］彭昊，郑慧锋，李皓桓，等.吡咯喹啉醌对体外培养雪旺细胞增殖及Cyclin E基因表达的影响［J］.中华实验外科杂志，2008，25：728-730.

　　［11］Mirsky R, Jessen KR, Brennan A，et al.Schwann cells as regulators of nerve development［J］.J Physiol Paris, 2002, 96:17-24.

　　［12］Mercurio F, Manning AM. Multiple signals converging on NF kappa B［J］. Curr Opin Cell Biol, 1999, 11:226.

　　［13］Armstrong SJ, Wiberg M, Terenghi G,et al.Laminin activates NF-kappa B in Schwann cells to enhance neurite outgrowth［J］. Neurosci Lett,2008,439:42-46.

作者单位：武汉大学人民医院骨科，武汉 430060　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30600627，30570496）；武汉青年科技晨光计划资助项目资助（编号：200750731256）