负载骨形态发生蛋白与血管内皮生长因子的

【摘要】  ［目的］探讨同时负载BMP、VEGF的PDLLA材料的体内成骨能力，以得到一种较好的可吸收骨构建材料。［方法］成骨细胞分离培养后负载到PDLLA材料中进行兔桡骨缺损修复实验，术后4、8、12 周行X线、组织学及扫描电镜观察骨生成状况, 12周行生物力学测试(三点折弯强度)。［结果］术后实验组各观察阶段骨形成明显高于对照组，第12周三点折弯强度与对照组相比差异有显著性(P<0.01)。［结论］负载BMP及VEGF两种细胞因子PDLLA支架材料修复兔桡骨缺损效果明显优于负载单一细胞因子PDLLA支架材料, 是一种有临床应用前景的骨移植材料。

【关键词】  超聚消旋乳酸　骨形态发生蛋白　血管内皮生长因子　骨缺损　骨髓基质干细胞

　　 Experimental studies on a new tissue engineering bone loaded with bone morphogenetic protein and vascular endothelial growth factor

　　WANG Daixian, MOU Shuling, WANG Jianran, et al.
　　Department of Orthopeadic Surgery, Rizhao People’s Hospital, Rizhao Shandong 276800,China
   
　　Abstract：［Objective］To investigate the efect on bone formation of PDLLA (PolyDLLactide) calcium BMP and VEGF and try to find the mechanism of optimizing composites so as to develop a new kind of absorbable osteosynthesis material.［Method］Highporosity foams of PDLLA  were implanted into bone defects. The specimens were harvested at 4, 8, 12 weeks after operation. The samples were examined by Xray, histology and scanning electronic microscope (SEM) to evaluate the effectiveness of defect repair. At 12 weeks after implantation of grafts, the biomechanical testing (bending strength) was used to study the quality of bone formation.［Result］There were significant difrences in bending strength between the experiment group and control group (P<0.01)．The experiment group was signficantly higher in bone formation compared with the control groups in every stage of postimplantation (P<0.01).［Conclusion］The PDLLA calcium with both BMP and VEGF composites have better osteoconductibility than calcium with novel bone formation. A composite of porous PDLLA Calcium BMP and VEGF is a new valuable bone transplantation material.

 　   Key words：polyDLLactide;  bone morphogenetic protein;  vascular endothelial growth factor;  bone defects；  marrow mesenchymal stem cells

　　由创伤、肿瘤切除、感染等原因造成的骨不连和骨缺损,尤其是大段骨缺损的修复一直是困扰着矫形外科、颅面外科的一大难题［1］。组织工程骨的体外构建可以用种子细胞和包含或不包含细胞因子的支架材料来进行。目前对单一细胞因子与成骨细胞的复合研究较多，取得了一定的结果。两种及两种以上的细胞因子的体内成骨机制、细胞因子间的协同作用及修复骨缺损的实验研究在国内未见报道。本组采用已经过研究证明对骨缺损修复具有确定促进作用的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）两种细胞因子同时负载到带有成骨细胞的超聚消旋乳酸（Poly  DL Lactide, PDLLA）支架材料上，进行兔桡骨缺损修复，实验效果良好，现报告如下。

  　  1  材料与方法

　　1.1  成骨细胞的分离培养
   
　　抽取新西兰兔骨髓，经条件培养液体外诱导、扩增。通过倒置相差显微镜、细胞染色、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况，并绘制细胞生长曲线 (MTT法)检测各组细胞增殖和细胞周期变化情况。采用碱性磷酸酶染色(ALP)和I型胶原免疫组化染色进行骨髓基质细胞成骨特性的鉴定。兔骨髓基质细胞经条件培养液体外诱导、扩增，ALP染色阳性率超过80％，体外培养的细胞能合成较多量I型胶原，表明所获得的骨髓基质细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC)是成熟的成骨细胞，可做为骨组织工程中一种良好的种子细胞。  

　　1.2 实验动物及分组
    　　
　　选用山东省医科院提供的新西兰大白兔54只(共108前肢), 雌雄不限，体重2.2～3.4 kg, 适应性饲养1周。麻醉后，在双前臂内侧作约3cm纵行切口，低速磨钻切取12 mm 桡骨，制作骨缺损模型。将108只前肢随机分为3组：在已负载BMSC 的PDLLA材料中：A组植入BMP及VEGF质粒；B组植入BMP；C组植入VEGF质粒。各组再分为4、8、12周3个时间点。

　　1.3  观察指标

　　1.3.1   观察动物术后活动及伤口愈合情况 

　　所有动物都能耐受麻醉和手术，术后动物无死亡。

　　1.3.2 大体标本观察 

　　各组分别在术后第4、8周处死2只动物，第12周处死其余动物。完整截取桡骨，观察植入材料的降解情况、与宿主骨界面结合情况及周围软组织反应。

　　1.3.3  影像学观察 

　　分别在术后第4、8、12周麻醉后拍摄尺桡骨正侧位片，投照统一条件为40 kV,50   Ma,0.2 s,距离为60 cm，观察骨缺损修复情况。阻射密度以同一X线片骨缺损临近正常骨区域相同面积皮质骨密度为100、相同面积X线片底色设为0测量的骨缺损阻射密度相对值表示。

　　1.3.4  组织学切片检查 

　　对骨缺损中部组织以体积分数10％的多聚甲醛固定，硝酸脱钙后石蜡包埋，连续横行及纵行切片，HE染色。每只动物取3张横行及纵行间断切片在100倍光镜下观察新骨形成情况并利用图像分析新生骨的面积百分比。每张切片随机取5个视野，分析新生骨小梁面积像素值，并计算其占视野总面积像素值的百分比。

　　1.3.5 生物力学检测
 
　　12周时选取各组动物中骨缺损修复效果最佳的标本，以3根正常兔桡骨标本为正常对照，在SMD10材料试验机(长春实验机研究所产)上作压轴应变、扭曲应变及三点弯曲试验，测试时温度为25℃，加速度1 mm/min。计算公式8f (MPa)=3 PL/2 bd2［ 注，P：最大破坏载荷(N)；L：试验跨度，即两点间的距离；b：试样的宽度(mm)；d：试样的厚度(mm)］。压轴应变、扭曲应变试验结果绘制位移-时间曲线，取曲线中近似直线部分斜率计算各标本的压缩、扭转刚度；三点弯曲试验记录标本断裂时的破坏负荷，并计算弯曲刚度。

　　1.4 统计学处理
    　　
　　计量资料的数据以±s表示, 所有数据均经正态性检验及方差齐性检验,采用SPSS 13.0统计软件，同一时间不同组标本骨缺损区的X线阻射密度、组织学切片、新生骨小梁面积比、生物力学检测数据的比较均采用单因素方差分析，均数间两两比较采用t检验，而对材料组三点弯曲强度比较，组内不同时间采用配对t检验，两组同一时间结果比较采用两样本均数比较的t检验。检验水准为α=0.05，P>0.05为统计学上无显著性差异，P<0.05为统计学上有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1  动物术后观察
     
　　大体观察：所有动物都能耐受麻醉和手术，术后动物无死亡。术后第1 d进食较少，行动迟缓。从第2 d开始恢复正常饮食和活动，伤口无感染迹象，I期愈合。术后4、8、12周取材时，各实验兔体重均明显减轻。

　　2.2 大体标本观察
     
　　术后4周A组骨缺损的断端及近尺骨侧有较多硬度较高的类骨样组织；B组骨缺损断端及中段近尺骨侧少量类骨质生成；C组表面有一层较致密的纤维组织膜包裹，植入的PDLLA被部分吸收，质地变软。8周A组及B组骨缺损区域出现连续性骨痴，C组PDLLA被大部分吸收，剩余少量纤维结缔组织。12周A组骨缺损区已完全修复，未见剩余PDLLA，且新生骨直径较邻近宿主骨直径略粗，完全离断后发现髓腔已再通;B组出现连续性新骨生成，但直径较邻近宿主骨部分纤细;C组仅发现骨缺损断端少许新生骨，缺损区域被大量结缔组织填充。

　　2.3 X线片观察

  　  术后4周X线片显示: A 组断端出现较多骨痂，宿主骨与植入组织工程骨之间界面模糊，植入材料部位出现散在局限性密度增浓影; B 组骨断端出现少量骨痂, 出现不连续的密度较正常骨偏低的骨痂，面积小，密度不高；C组可见清晰骨缺损区，宿主骨断端清晰,可见少许骨痂形成；实验组(图1a、b、c)在术后8周X线显示: A 组断端两侧有骨痂生长,出现广泛的高密度影，骨缺损区域新生骨皮质连续性恢复，可见部分髓腔。B组可见两断端骨痂生长, 有向中线聚集趋势,骨缺损处仍有明显的凹陷。C组骨缺损区见新生骨痂少量，骨折断端较圆滑(图1d、e、f)。术后12周X线片显示: A 组组织工程骨与宿主骨之间的骨痂已完全骨化，髓腔贯通。B 组缺损区骨痂密度、数量增加，但明显直径低于断端宿主骨。C组至12 周时大部分形成假关节, 少部分断端硬化停止生长。 (图1g、h、i )。本实验各组不同时相骨缺损修复的X线阻射密度值均为实验组>对照组>空白组，具体见(表1)。B组12周时成骨达75％以上， A组达90％，各组成骨评分情况见图2，B组与C组相比有显著性差异(x =- 4.64,P<0.01)， A组与C组相比有显著性差异(x= - 4.816, P<0.01)，12周时 A组与B、C组两组间有显著性差异(x= -8.862,P<0.01)。表1  X线分析各组骨缺损平均阻射密度（略０

　　2.4  组织学切片观察
  
　　4周A组己降解成网状，缺损区内大量软骨细胞生成，含少量骨基质，B组可见较多软骨细胞生成，C组为纤维组织和大量淋巴细胞(图1j、k、l)。8周A组仅剩余少量网状PDLLA，生成大量较成熟的编织骨，可见少许软骨基质，B组成熟骨组织较少，大部分为软骨基质填充，空白组主要为纤维组织(图1m、n、o )。12周A组完全为成熟的骨组织，B组仍可见部分软骨基质，C组缺损靠近宿主骨区域可见少许软骨细胞及软骨组织，其余部分为纤维组织填充(图1p、q、r)。各时间段新生骨小梁量:A>B>C组，3组不同时相骨缺损区新生骨小梁的图像分析结果见（表2、图2）。表2  分析各组不同时相骨小梁占骨缺损区域面积百分比（略）

　　2.5 生物力学测试
   
　　术后12周A、B、C组的压缩、扭转刚度与三点弯曲试验最大负荷(破坏负荷)（表3）。各组骨断裂平面均为骨缺损中央部分，A组标本在断裂平面可见明显髓腔再通，B组与C组未观察此现象。表3  术后12周各组标本压缩、扭转刚度与三点弯曲最大负荷（略）

   　 骨组织工程支架材料应具有以下特点［2］：（1）良好的生物相容性和降解性，体内降解产物对人体无害；（2）具有一定骨诱导性和骨传导性，利于细胞贴附及增殖；（3）有一定强度，在机体内保持自身形状并能对抗外力；（4）易于塑形，可根据需要加工成各种形状和大小；（5）具有负荷最大量细胞的高渗透性；（6）支持成骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构；（7）可与其他生物活性分子如骨形态发生蛋白(BMP)、转移生长因子β( TGFβ)复合、控释从而对种子细胞的生长进行调控；（8）易消毒性。

 　   BMP是研究较早的骨生长因子，其诱导成骨作用已被实验证实，是唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子，能诱导未分化的间充质细胞向骨系细胞转化，促进骨细胞的生长增殖。目前对组织工程骨中负载BMP 的量尚无一定标准，胡稷杰等［3］通过在PLGA与BMSCs 复合构建的组织工程骨支架材料上分别负载5.0 mg、2.0 mg、1.0 mgBMP进行兔桡骨缺损的修复实验研究，结果发现含5.0 mgBMP 的PLGA支架与BMSCs复合构建的组织工程骨修复兔桡骨15mm骨缺损的效果最佳。   VEGF 作为特异内皮细胞分裂素，是唯一对血管形成具有特异性的重要生长因子，能促进血管内皮细胞增殖、血管生成。尚可作用于内皮细胞使其形状改变并刺激增殖，并且可刺激单核细胞及成骨细胞的迁移［4］。聚乳酸（PLA）是最早作为骨、软骨组织工程的支架材料，也是目前运用最广泛的骨组织工程材料［5］。Robinson等认为孔径在200～300 μm有利于骨介导，常规细胞种植技术只能在使用75％以上的孔隙率的材料才能成功。本实验中所用PDLLA材料将孔径控制在150～200 μm，孔径率85％～95％。可降解性支架材料的研究大多采用在支架材料上负载成骨细胞和各种具有促进骨折愈合的细胞因子，对单一细胞因子与成骨细胞的复合研究较多，取得了一定的结果，但两种及两种以上的细胞因子的体内成骨机制、协同作用及修复骨缺损的实验研究在国内未见报道。

   　 骨组织工程支架材料分为无机材料和有机材料两大类。前者有良好的生物相容性、生物降解性以及骨传导性，最大缺陷在于降解极其困难，影响了新生骨的生成和改建。后者的生物相容性好，利于细胞贴附、增殖、分化，但机械强度不够，降解时间难以控制。近期有报道试图将磷酸钙颗粒与PLA以一定比例混合以达到改善支架机械性能的目的［6］。三维立体的网孔状PDLLA具有良好生物相容性、可降解性和加土的可控性［7，8］，但仍存在亲水性较差、缺乏良好的生物活性等缺陷。在下一步的实验研究中，我们将探讨天然材料与PDLLA进行复合以改变和优化材料的性能，再把一系列的骨生长因子加入改性后的材料中，构建生长因子的缓释系统，以期在骨修复过程中，生物活性因子能持续不断地释放，进一步诱导骨修复的进程。

   　  综上所述，同时负载BMP和VEGF的PDLLA多孔支架材料修复骨缺损的效果理想，明显优于单纯应用BMP及VEGF的PDLLA多孔支架材料，有望在骨组织工程中得到广泛应用。

【参考文献】
  　　［1］龚泰芳,夏仁云.成骨细胞和组织工程化生物活性骨［J］.中国矫形外科杂志，2002,9 :23-25.

　　［2］裴国献,陈 滨.医学临床对组织工程学的要求［J］.中华创伤杂志,2001,7 : 389.

　　［3］胡稷杰,金 丹,全大平,等.负载不同浓度骨形态发生蛋白的组织工程骨体内成骨的量效关系［J］.中华骨科杂志，2006,3:196-201.

　　［4］Duyndam MC, Hilhorst MC, Schluper HM, et al. Vascular endothelial growth factor 165 overexpression stimulates angiogenesis and induces cyst formation and macrophage infiltration in human ovarian cancer xenografts［J］.Am J Pathol,2002,2 : 537-548.

　　［5］Uirk RA, Chan WC, Davies MC,et al.poly(1lysine)GRGDS as abiomimetic surface modifier for Poly(lactic acid)［J］.Biomaterials,2001,8:865-972.

　　［6］Navarro M, Ginebra MP, Planell JA,et al. Development and cell response of a new biodegradable composite scaffold for guided bone regeneration［J］. J Mater Sci Mater Med, 2004, 4:419-422.

　　［7］Min SX, Jin AM, Zhang L, et al.PolyDLlactide (PDLLA)with diferent pore sizes to repair the mdial defect in rabbits［J］．Xiandai Kangfu, 2001,4:58-59.

　　［8］Zhang L, Jin AM, Gao LB, et al. The study of 20％ β-TCP/PDLLA on hydrophilic property, security and biocompatibility［J］. Zhongguo Linchuang Kangfu, 2002,22: 3342-3343.

作者单位：1. 山东省日照市人民医院, 276800; 2.山东省日照市中医医院, 276800;3.山东省日照市东港医院, 276800; 4.济南军区总医院, 济南 250014