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［摘 要］ 目的 克隆人趋化因子MIP-3α基因，表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。 方法 从扁桃体中提取总RNA，再进行RT-PCR，扩增MIP-3α成熟蛋白基因，并在5'和3'分别添加NcoI和EcoRI酶切位点，通过这两个酶切位点重组于pET32a（+）载体上，转化E.coli.DH5α，筛选阳性克隆，酶切鉴定，DNA测序检测插入序列的正确性，缺失突变获得MIP-3α天然蛋白表达载体pET32a（+）.MIP-3α，SDS-PAGE分析其表达，Western blot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化MIP-3α融合蛋白。 结果 成功克隆了MIP-3α基因，表达并初步纯化得到MIP-3α融合蛋白。 结论 构建的MIP-3α硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达MIP-3α硫氧还蛋白。
［关键词］ MIP-3α;融合表达;载体;Western blot;蛋白纯化
Gene cloning and expression of human chemokine MIP-3α
LUO Fu-kang，ZHENG Hong，SHEN Da-bin
（Laboratory Research Center，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing400038，China）
Abstract:Objective To clone human chemokine MIP-3αand to express and purify macrophage inflammatory protein3α（MIP-3α）fusion pro-tein.Methods Total RNAwas extracted from human inflammatory tonsil and its cDNAwas generated by reverse transcription.Mature MIP-3αgene was amplified by PCR and NcoⅠand EcoRⅠsites were added to the5'and3'end，respectively.PCR product was cloned into pET32a（+）with the two sites.E.coli DH5αwas transfected with the recombinant plasmid，and positive clones were selected.The insert DNAwas verified by enzyme digestion and DNA sequencing.The fusion expression vector of mature MIP-3αwas formed with deletion mutation.Expression ofMIP-3αwas analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.MIP-3αfusion protein was purified.Results Human chemokine MIP-3αwas successfully cloned，and the fusion protein was expressed and purified.Conclusion The constructed fusion expression vector can express MIP-3αfusion protein in manner of soluble protein.
Keywords:MIP-3α;fusion expression;vector;Western blot;protein purification
趋化因子是由小分子分泌蛋白组成的一个大的细胞因子超家族，是能够诱导白细胞做定向运动的细胞因子，在病原体的清除、炎症反应、移植排斥、造血、血管生成、肿瘤转移、HIV感染等过程中发挥着重要作用［1-2］ 。MIP-3α（Macrophage Inflammatory Protein3α.CCL20），主要表达于皮肤角质形成细胞和粘膜上皮细胞，其受体目前仅发现CCR6，该受体主要表达细胞为LC（朗罕氏细胞）和记忆型T淋巴细胞。MIP-3α对诱导LC和记忆型T淋巴细胞进入外周组织，产生特异性细胞免疫反应起着重要作用［3-4］ 。在免疫排斥反应过程中，DC细胞向T淋巴细胞提呈抗原是免疫排斥反应发生的关键环节。为了阻止或减轻免疫排斥反应的发生，我们希望得到MIP-3α受体CCR6的拮抗剂。为此，本研究构建了MIP-3α的融合蛋白表达载体，表达并纯化得到MIP-3α融合蛋白，为后续的研究工作奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本 采用西南医院耳鼻喉科慢性扁桃体炎患者手术摘除的扁桃体。
1.1.2 质粒及菌株 E.coli.DH5α本室保存，E.coli.BL21trxB（DE3），大肠杆菌表达质粒pET32a（+），购自美国Nova-gen公司。
1.1.3 试剂 总RNA（tRNA）提取试剂Tripure Isolation Re-agent、质粒提取试剂盒为德国Roche公司产品;逆转录试剂盒Improm-ⅡRT System、高保真热稳定DNA聚合酶Tli、琼脂糖、胶回收试剂盒、限制性内切酶NcoI和EcoRI、T4连接酶，为美国Promega公司产品;IPTG为Sigma公司产品;羊抗人MIP-3α多抗购自R&D公司，兔抗羊二抗（辣根过氧化物酶标记）购自中山公司，TALON金属离子亲和层析树脂购自CLONTECH公司，AK-TA Explorer高效层析系统、Hiprep26.10除盐柱、Hiprep16.10CM FF弱阳离子交换柱均购自英国Amersham Pharmacia公司，其它化学试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取 标本收集后立即分成100～200mg的小块，液氮冻存2h，取出放-70℃冻存。总RNA提取采用Tri-pure Isolation Reagent，按操作说明进行。总RNA-70℃保存。
1.2.2 RT（逆转录） RT（逆转录）采用Improm-ⅡRT System，模板为提取的总RNA，引物为Oligo（dT）15，逆转录酶为Improm-Ⅱ TM Revese Transcriptase，25℃退火5min，42℃逆转录1h，70℃灭活逆转录酶15min，-20℃保存备用。
1.2.3 PCR 根据Genebank公布的MIP-3αmRNA序列（登录号U77035），设计上游引物为5'CATGCCATGGCTG-CAAGCAACTTTGACTGCT3'，下游引物为5'CGGAATTC CTACAG-GTTCTTGACTTTTTT3'。同时在5'引入NcoI位点，3'引入EcoRI位点。以RT产物为模板，按每反应2U加入Tli高保真DNA聚合酶，常规PCR条件进行扩增。反应条件:94℃预变性5min，然后按如下参数进行40个循环:94℃，1min，50℃，1min，72℃，2min。最后一个循环结束后72℃延伸5min。
1.2.4 PCR产物回收纯化、质粒提取 采用Wizard（r）SV Gel and PCR Clean-Up System回收纯化，质粒提取采用High Pure Plasmid Isolation Kit，按操作说明进行。
1.2.5 酶切反应、连接和转化 按分子克隆第3版方法进行。
1.2.6 阳性克隆的挑选 对阳性克隆进行酶切验证（NcoⅠ、EcoRⅠ双酶切），挑选3个含插入片段的质粒由上海基康公司以S-Tag、T7启动子引物同时测序，以保证整个融合蛋白基因的正确性。测序正确的重组质粒命名为pET32a（+）.MIP-3α。
1.2.7 缺失突变 为了使融合蛋白经肠激酶酶切后得到MIP-3α天然蛋白，本实验针对肠激酶位点与天然蛋白基因间的3个氨基酸设计了一对特异性缺失突变引物，正向GGTAC-CGACGACGACGACAAGAAGCAACTTTGACTGCT，反向CCATGGCT-GCTG CTGCTGTTCTTCGTTGAAACTGACGA，突变反应按Stratagen QuickChange（r）突变试剂盒操作说明进行。突变后的质粒命名为pET32a（+）.MIP-3α。
1.2.8 pET32a（+）.MIP-3α在大肠杆菌中的表达 以pET32a（+）.MIP-3α质粒转化感受态大肠杆菌BL21trxB（DE3）。将1.5ml过夜培养的菌液转入50ml培养液37℃摇瓶培养，待悬液OD600nm达到0.55时，留1ml菌液电泳，再加入IPTG（终浓度为1mmol.L），继续培养3h，取3ml菌液离心，将沉淀悬于1.10倍培养体积的PBS中，超声裂菌，离心，取上清和沉淀与前述样品同时进行SDS-PAGE电泳。
1.2.9 目的蛋白的表达 将含有重组原核表达质粒pET32a（+）.MIP-3α的大肠杆菌BL21trxB（DE3）接种于100ml含50μg.ml氨苄青霉素、15μg.ml卡那霉素的LB培养液中，37℃、250r.min摇动培养过夜。将菌液按5%分别接种于2L上述LB培养液中，摇动培养3～4h，直至OD600nm在0.6～0.8之间。加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol.L，继续摇动培养3h。离心收集细菌。每升发酵菌以100ml PBS重悬，-80℃冻存。次日将冻存菌液于37℃冻融裂解，以BioNeb挤压式细胞破碎仪，100psi，挤压4次，以去除裂解菌液的粘性。4℃，15000×g离心20min，分别收集上清和沉淀，各取少量用于SDS-PAGE电泳。
1.2.10 融合蛋白的金属亲和层析 以TALON金属亲和树 脂进行纯化，留样SDS-PAGE电泳。
1.2.11 除盐 以50mmol.L TrisHcl缓冲液，pH8.0除盐，除去洗脱产物中的NaCl和咪唑。除盐柱为Hiprep26.10Desalting，流速为5ml.min，上样3ml.min，收集洗脱下的蛋白峰。
1.2.12 弱阳离子交换层析 按蛋白等电点的不同分离蛋白。弱阳离子交换层析柱为Hiprep16.10CM FF，平衡液为20mmol.L TrisHcl缓冲液，pH8.0，洗脱液为20mmol.L TrisHcl缓冲液，pH8.0，1mol.L NaCl。流速为5ml.min，上样3ml.min。连续梯度洗脱液（0～100%）洗脱，20柱床体积（CV），收集洗脱下的蛋白峰。取样电泳。
2 结果
2.1 总RNA提取
提取出的总RNA经1%琼脂糖电泳鉴定，可看到两条清晰的条带，分别为28S和18S，28S∶18S约为2∶1。
2.2 RT-PCR
扩增产物经1%琼脂糖电泳鉴定，得到长度在200～300bp的MIP-3α成熟蛋白DNA扩增产物（图1）。
1:MIP-3αPCR产物;2:100bp DNA标记
图1 琼脂糖凝胶电泳分析MIP-3αPCR产物（略）
2.3 pET32a（+）.MIP-3α质粒的构建
PCR产物经NcoⅠ、EcoRⅠ分别单酶切并纯化后与同样NcoⅠ、EcoRⅠ分别单酶切并纯化的pET32a（+）载体相连接，构建MIP-3α-Trx融合表达质粒。连接产物转化感受态E.coli.DH5α，氨苄青霉素抗性LB平板筛选，采用NcoI、EcoRI双酶切鉴定阳性重组子（图3），取3个含插入片段的阳性克隆进行DNA测序分析，缺失突变后再进行DNA测序，结果显示插入的MIP-3α基因、硫氧还蛋白基因与Genbank报道完全一致。
1:MIP-3α阳性克隆（NcoⅠ、EcoRⅠ双酶切）;2:100bp DNA标记
图2 MIP-3α阳性克隆酶切验证 （略）
2.4 pET32a（+）.MIP-3α质粒在E.coli.BL21trxB（DE3）中的表达
发酵菌在用IPTG诱导与未诱导样中表达量差异明显，所表达的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE电泳结果表明MIP-3α-Trx融合蛋白大小约26KDa，与理论值27.1KDa基本一致（图3）。Western blot证实表达的为MIP-3α融合蛋白（图4）。
1:未诱导菌裂解液总蛋白;2:诱导菌裂解液上清蛋白;3:诱导菌裂解液沉淀蛋白;4:金属离子亲和层析蛋白流出峰;5:离子交换层析蛋白流出峰1;6:蛋白分子量标记
图3 SDS-PAGE分析融合蛋白表达（略）
1:蛋白分子量标记;2:pET32a（+）.BL21trxB（DE3）诱导菌裂解液总蛋白;3:pET32a（+）.MIP-3α.BL21trxB（DE3）诱导菌裂解液总蛋白
图4 MIP-3α重组蛋白的Western blot分析（羊抗人MIP-3α多抗血清为一抗）（略）
2.5 MIP-3α融合蛋白的初步纯化
融合蛋白经TALON金属亲和树脂吸附后，融合蛋白占总蛋白的65%～80%以上。除盐后经弱阳离子交换，MIP-3α融合蛋白得到有效纯化（图3）。
3 讨论
本研究首次在国内报道成功克隆人MIP-3α基因，并在pET32原核表达系统中得到有效表达，经金属亲和层析和离子交换得到初步纯化的MIP-3α融合蛋白。初步建立了MIP-3α融合蛋白表达和纯化的流程。通过该方法来表达和纯化MIP-3α的突出优点是流程短，成本较低，技术成熟，可靠性高。本研究构建的MIP-3α融合蛋白表达载体为构建MIP-3α突变体并进一步获得MIP-3α的拮抗剂奠定了基础。目前，国内外尚无关于MIP-3α与移植免疫排斥关系的研究，对于MIP-3α的研究多集中在肿瘤免疫方面。一方面，研究发现多数肿瘤细胞可表达CCR6受体，因此表达MIP-3α较多的器官会有肿瘤转移。应用MIP-3α抗体中和MIP-3α后，可阻断CCR6与MIP-3α的结合，可显著减少肿瘤转移［5］ 。另一方面，MIP-3α是一种强有力的肿瘤抑制剂，肿瘤内直接注射MIP-3α可使DC和CD8 + T细胞侵润到肿瘤实质内，能明显抑制肿瘤的生长［6］ 。本研究成功构建了MIP-3α表达载体，可稳定地大量表达MIP-3α蛋白，在此基础上可利用基因突变技术筛选CCR6的拮抗剂，为研究趋化因子MIP-3α在移植免疫学中的功能奠定基础。
［参考文献］
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［3］Izadpanah A，Dwinell MB，Eckmann L，et al.Regulated MIP-3α.CCL20production by human intestinal epithelium:mechanism for modulating mucosal immunity［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280（4）:G710-G719.
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［6］ Balkwill F.Chemokine biology in cancer［J］.Semin Immunol，2003，15（1）:49-55.
（编辑:余汇洋）
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（30170900）
（第三军医大学:附属西南医院实验研究中心，重庆400038;附属新桥医院检验科，重庆400037）