人泌尿系上皮肿瘤疫苗的初步研究

【摘要】  目的通过筛选噬菌体随机12肽库获得MUC1糖链抗原模拟表位。方法利用纯化获得的Ma695抗体筛选噬菌体随机12肽库，通过夹心ELISA分析噬菌体克隆，测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析，竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选，获得了14个阳性克隆，DNA序列分析并推导出氨基酸序列：KHYDPFHHRMPQ，QADTARSVALAG，VPSKPDLHVRSI，MTPIHYWNHNRV。鉴定结果表明4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列KHYDPFHHRMPQ，QADTARSVALAG，VPSKPDLHVRSI，及MTPIHYWNHNRV模拟了MUC1抗原表位。

【关键词】  MUC1抗原 模拟表位 噬菌体随机12肽库

    A study on epithelium tumor vaccine in urologic system

    WANG Xiangwei， ZHANG Lixin， ZHANG Yuanning， YE Gang， ZHANG Genfu (Department of Urology，Xinqiao Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400037， China)

    Abstract   ObjectiveTo identify and characterize the mimic epitope of MUC1 from phage display random 12 peptide library. Methods The purified Ma695 antibody was used to screen in phage display random 12 peptide library. The positive clones were identified by sandwich ELISA， competitive inhibition assay. The homologous comparison of amino acid sequences of positive clones was conducted through searching the protein sequence databank. The digestion analyses of amino acid sequences were also conducted by software. Results 14 positive clones were acquired after 3 rounds of screening. Amino acid sequences deduced from DNA sequences showed four different sequences as KHYDPFHHRMPQ， QADTARSVALAG， VPSKPDLHVRSI， MTPIHYWNHNRV. The inhibitory assay showed that the 4 mimic epitope peptides displaying on the phage surface could effectively inhibit the combination of antibody with antigen and the inhibitory rates of each mimic epitope were 50% higher than that in the control. Conclusion The results shows that KHYDPFHHRMPQ，QADTARSVALAG，VPSKPDLHVRSI，MTPIHYWNHNRV are the mimotopes  which could mimic the epitope of MUC1.

    Keywords: Mucin 1; mimic epitope; phage display random 12 peptide library

    泌尿系肿瘤是泌尿外科疾病中最常见的疾病,深入研究其治疗方法具有重要的临床意义。正常情况下泌尿生殖道腺上皮细胞的管腔面顶部都有MUC1的表达。但在膀胱癌、前列腺癌、精囊癌等腺癌中MUC1呈异常表达：①表达量增高；②极性分布消失；③糖链的糖基化不全，糖链变短，分枝少，结构简单，导致新糖链表位形成和正常情况下隐蔽的肽链表位暴露，使MUC1成为可被免疫系统识别的肿瘤抗原［1］。由于MUC1具备以上特点，使其成为多种上皮性肿瘤免疫治疗的新靶点，通过机体的体液和细胞免疫机制能有效免除MUC1高表达肿瘤细胞。为研发人泌尿系上皮肿瘤疫苗，本文应用MUC1糖链抗体筛选噬菌体随机12肽库获得了MUC1模拟表位，报告如下。

    1材料与方法

    1.1材料

    Ph.D.12TM肽库(NEW ENGLAND Biolabs)为展示在噬菌体pIII蛋白N端的12肽库，库滴度为4×1012 pfu/ml， 随机多样性（complexity）为1.9×109，所用受体菌为XL1blue (tetr)，均由张立新博士惠赠。-96 gIII测序引物 5’C TCA TAG TTA GCG TAA CG 3’, 由大连TaKaRa公司合成。MUC1 抗体Ma695由本室纯化制备；4D抗体为正常组织MUC1抗体。

    1.2方法

    1.2.1噬菌体滴度的测定取含＜100 fu的平板计蓝斑数目，计算噬菌体滴度。噬菌体滴度=蓝斑数×稀释度×102 (pfu/ml) 。

    1.2.2Ph.D.12肽库的生物淘洗第一轮：用包被液将Ma695抗体浓度调为100 μg/ml，每孔加入150 μl抗原液，4 ℃湿盒中过夜。封闭液, 4 ℃放置1 h。加入10 μl (4×1010 pfu)噬菌体库液,常温轻摇60 min。洗脱液漂洗后, 立即加入30 μl 中和液，混匀。取洗脱液测滴度。剩余洗脱液进行扩增。第二、三轮:方法同第一轮，MA695浓度调为10 μg/ml，加入2×1011 pfu扩增噬菌体, TBST中Tween20 的浓度提高到0.5%(V/V)。

    1.2.3噬菌斑的扩增用枪头挑取单个第三轮扩增后测定滴度后的蓝斑，接种培养基，37 ℃，260 r/min，4.5 h，离心取80%上清，4    ℃保存或加入甘油至终浓度50%后，-20 ℃保存。

    1.2.4夹心ELISA分析获得的噬菌体克隆 将Ma695抗体用包被液稀释成10 μg/ml,包被双条可拆酶标板， 4 ℃过夜。加入扩增后的噬菌体，同时取2 μl原库+200 μl TBST作为对照，加入HRP/AntiM13单抗后显色，50 μl l2 M H2SO4终止显色，测定OD450。

    1.2.5测序模板的快速纯化及DNA测序扩增噬菌斑。DNA沉淀重悬于30 μl TE。送测序。

    1.2.6竞争抑制实验将人MUC1蛋白包被微孔，BSA封闭，阳性噬菌体克隆与Ma695 抗体室温共孵育2 h后，加入微孔，37 ℃孵育 1 h后，缓冲液洗涤，加入HRP标记的羊抗鼠抗体，TMB显色。测OD450值。计算抑制率：抑制率=(抑制前OD450 -抑制后OD450)/抑制前OD450×100%。

    2结果

    2.1Ph.D.12肽库的生物淘洗

    按上述方法所述，进行3轮生物淘洗，噬菌体克隆获得有效的富集达110倍。

    2.2噬菌体克隆的ELISA分析

    从上述筛选获得的噬菌体克隆中挑选MUC1 OD450 /4D OD450＞2.0者，共获得14个阳性克隆。

    2.3噬菌体阳性克隆的DNA序列测定及分析

    根据测序结果的比较，将其分为两种类型 ,第一类为相同序列模式: KHYDPFHHRMPQ （t1,3,4,6,7,17,16,10,9,8,11）；第二类为单一序列模式: QADTARSVALAG（t2），VPSKPDLHVRSI （t5），MTPIHYWNHNRV（t13）。依据其氨基酸序列同源程度，未发现获得其同源性基序。所得序列与MUC1序列比对，亦未发现同源性序列，说明筛选得到的表位是MUC1的模拟表位。

    2.4噬菌体克隆的竞争抑制实验

    与Ma695特异性结合的噬菌体克隆做竞争抑制试验，结果4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上（分别为79.34%，64.71%，73.57%及51.96%），能较大程度地特异性抑制抗原抗体结合，提示这些阳性克隆的外源肽具有一定的MUC1抗原模拟功能。 

    3讨论

    近来研究发现，粘蛋白分子可以保护肿瘤细胞不受CTL细胞和NK细胞的细胞毒作用。粘蛋白分子可以覆盖在肿瘤细胞的表面，阻碍免疫细胞和抗体与肿瘤抗原的接触，使ADCC作用和免疫效应细胞不能激活。对许多上皮性肿瘤如乳腺癌、膀胱癌、直肠癌和卵巢癌的研究发现，肿瘤细胞可以改变其表面粘蛋白如MUC1的表达，这些粘蛋白分子的表达改变有助于肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。另外，肿瘤细胞表面蛋白糖基化的异常，也可以使蛋白抗原决定簇被封闭或者改变肿瘤细胞的一生物学活性，有助于免疫逃避。正是由于上述原因，肿瘤细胞无法有效激活自身T淋巴细胞，并可导致T细胞耐受或缺失的出现。应用肿瘤疫苗的目的是为了有效激活自身T淋巴细胞，打破原有的免疫耐受局面［24］。

    本研究所选择的MUC1粘蛋白作为一个肿瘤相关抗原，已被一些研究者作为一个肿瘤主动免疫治疗的理想靶抗原。虽然肿瘤MUC1的多肽表位正常时被糖链覆盖，不易引起免疫应答，但MUC1毕竟是一种自身抗原，在用MUC1多肽进行免疫治疗时，并不能完全排除产生自身免疫的可能性。因此，用MUC1的模拟表位作为肿瘤疫苗，作为一种异源分子，一方面可增强其免疫原性，另一方面可减少诱发自身免疫的机会。

    目前的研究显示，筛选配基中能与噬菌体多肽结合的位点仅有数个，这些位点通常都是筛选配基与其配体的结合部位或活性位点。因此，通过筛选所获得的结合肽具有一定的特异性和亲和力。亲和筛选中，即使经过多轮筛选，也不能排除非特异性噬菌体克隆的存在，因而进一步挑取单个克隆，确定它与筛选配基的特异性吸附是实验必不可少的步骤。其中，ELISA能半定量测定筛选配基与噬菌体克隆间的结合常数，是最为常用的方法［57］。实验中，我们应用该方法筛选阳性克隆，采用不相关抗体4 D（识别正常MUC1蛋白的抗体）作为阴性对照，以Ma695 OD450 /4D OD450＞2.0作为阳性结果判定标准，避免了由于噬菌体用量过大所可能造成的假阳性，所获得的实验结果较为可靠。

    由于抗原与抗体结合的位点一般由几个氨基酸残基组成，随机肽库中就有部分多肽可以模拟或组成抗原表位而与抗体结合，通过对筛选获得的多肽进行序列和结构分析，就可得到一系列不同的短肽，其中许多序列可能具有共同的或者相似的序列，称为基序（motif），这种序列极有可能为蛋白分子上的抗原表位。带有基序的噬菌体克隆或根据基序化学合成的多肽若能竞争性的阻断抗体与抗原的结合，表明该基序在一定程度上模拟了蛋白质的表位。蛋白质抗原与抗体的结合表位长度约35个氨基酸，许多抗体的结合表位已被确定［89］。因此，可用噬菌体随机肽库筛选抗原模拟表位。

    用识别连续抗原表位的单抗进行筛选时，往往能够从随机肽库得到许多与抗原表位的同源性很高的表位，但也有许多作者报道了用识别连续抗原表位的单抗从噬菌体随机肽库中筛选出与相应抗原没有同源性的序列，推测该抗体可能识别一种不连续的或结构上的新型表位［10］。我们应用识别MUC1抗原表位的Ma695单抗筛选噬菌体随机12肽库，挑选从筛选获得的噬菌体克隆，进行插入肽的DNA序列测定。根据测序结果的比较，将其分为两种类型 ,第一类为相同序列模式: KHYDPFHHRMPQ （x11）；第二类为单一序列模式: QADTARSVALAG（x1），VPSKPDLHVRSI （x1），MTPIHYWNHNRV （x1）。依据其氨基酸序列同源程度，未发现其同源性基序。所得序列与MUC1序列比对，亦未发现同源性序列，说明筛选得到的表位是MUC1的模拟表位。由于糖链抗体识别的是肿瘤细胞表面抗原分子上的糖链，所以本研究筛选到的表位只能是模拟表位，是用多肽来模拟多糖抗原与糖链抗体的结合。此种模拟表位的鉴定与蛋白抗原线性表位的鉴定不同，蛋白抗原线性表位的鉴定可以通过噬菌体表面呈现的多肽序列与天然抗原的氨基酸序列的同源性比较来确定筛选到的表位是否正确。而模拟表位的鉴定无法进行同源性比较，只能通过功能分析来判断该多肽是否为抗原的模拟表位。本实验采用了ELISA方法和竞争抑制实验来鉴定糖链抗体的模拟表位。结果显示4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上，能较大程度地特异性抑制抗原抗体结合，提示这些阳性克隆的外源肽具有一定的MUC1抗原模拟功能。

    本研究在获得MUC1模拟表位肽序列的同时，亦获得了展示在噬菌体表面的4个MUC1糖链抗原模拟表位阳性噬菌体克隆，该模拟表位以融合蛋白形式展示在噬菌体表面，因此利用这些阳性噬菌体克隆，可作为携带该模拟表位的免疫载体，用于免疫小鼠有可能激发机体的体液免疫反应，产生针对MUC1的体液和细胞免疫应答。

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作者单位：第三军医大学附属新桥医院泌尿科，重庆 400037