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【摘要】 目的 探索新生大鼠脊髓星形胶质细胞的分离、培养与传代及纯化方法，鉴定其培养纯度。方法 分离、培养新生大鼠脊髓星形胶质细胞，用换液时暴露结合旋转法加以纯化，酶消化法传代后进行免疫组化鉴定，并染核计数星形胶质细胞的纯度。结果 星形胶质细胞贴壁快，多在12 h内，3 d后数量显著增加；免疫细胞化学染色显示，NF200抗体染色为阴性，提示培养盖片中不含神经元；GFAP阳性染色细胞高达95.8%。结论 换液时短暂暴露结合恒温旋转法可纯化得到高纯度的星形胶质细胞，是一种简单、高效的星形胶质细胞纯化方法。
【关键词】 星形胶质细胞；神经微丝蛋白；胶质纤维酸性蛋白
Purification and identification of astrocyte of spinal cord in vitro
WEN Can, LI Shu-rong, SU Bing-yin (Department of Neurobiology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract: Objective To explore the method of isolation, culture, and purification of astrocyte derived from spinal cord of neonate rats, and identified by immunocytochemical stain. Methods Astrocyte derived from spinal cord of neonate rats were isolated and cultured, purified by exposed a short time when exchanging medium and rotation. Passage through enzyme digestion and identified by immunocytochemical stain, to count the purity coefficient of astrocyte. Results Astrocytes adhered after plated 12 h, the numbers increased significantly after 3 d. Immunocytochemical stain showed: there were no neuron on culture covers because the stain of NF200 was negative, while the positive rate of GFAP stain was up to 95.8%. Conclusion High purified astrocytes could be got by exposed a short time when exchanging medium and rotation, so it is a simple and high effective method for the purification of astrocyte.
Keywords: astrocyte; neurofilament; glial fibrillary acidic protein
近年，神经胶质细胞（astrocyte，AST）已成为神经科学研究的热点之一［1］，它不仅具有支持、分隔、营养和保护神经元的作用，而且参与了脑的高级功能活动，并在突触形成中起着重要作用［2-3］。AST的分离、培养方法报道较多，取材部位以大脑皮层为主，脊髓相对较少，纯化方法常以多次传代为主。因此，有必要对星形胶质细胞的分离、培养与传代和纯化进行系统的研究，并对其培养纯度进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
DMEM培养基、D-Hank液和胎牛血清（FBS）皆购自Gibco公司，L-谷氨酰胺、Hoechst、胰蛋白酶和小鼠抗神经微丝单克隆抗体（NF200抗体）购自Sigma公司，兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC标记山羊抗小鼠-IgG和抗体稀释液皆购自北京中杉金桥生物技术有限公司。显微镜型号为Olympus BX-60，荧光激发装置为Olympus MODEL BH2-RFL-T3，CO2培养箱THERMO FORMA 3111。
1.2 细胞的分离和培养
取新生24 h内Sprague-Dawleyr大鼠（购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心），参照McCarthy等［4］的方法加以改进。取新生24 h内的SD大鼠酒精浴后在无菌条件下取脊髓，置冰浴D-Hank液中，分离、剪碎脊髓组织，置离心管中，加10倍0.125%胰蛋白酶，在37 ℃下消化15 mim，用含血清培养基终止消化，过200目筛网，1 100 r/min离心5 min，弃上清，加入DMEM培养基(含10％FBS)，轻柔吹打，制成细胞悬液，调节细胞密度为1×106/mL，接种在25 cm2 培养瓶中，置37 ℃二氧化碳孵箱，每3 d半量换液1次。
1.3 AST的纯化
每次换液都要将培养液吸干，使细胞在空气中暴露10秒钟以杀死少突胶质细胞；待细胞基本铺满培养瓶后，在37 ℃、280 r/ min摇18 h，倒去培养液并用新鲜培养液漂洗3次，将所得纯化星形胶质细胞用二次酶消化法传代，用含血清（10%）培养液将细胞密度调至1×106/ mL，种植到培养皿中的盖玻片上（用作免疫组化鉴定）和培养瓶内，每3 d半量换全培养液1次，直至细胞融合。
1.4 AST的鉴定
对培养的AST作免疫细胞化学染色鉴定，GFAP与NF200抗体作免疫荧光双标，并用Hoechst染核标识细胞总数，计数AST的纯度。简言之，培养盖片经PBS漂洗2次，4 ℃丙酮室温固定10 min，PBS漂洗5 min×4次，加NF200抗体（1∶1 000）50 μl/盖片，37 ℃湿盒孵育1 h后4 ℃冰箱过夜，PBS漂洗5 min×3次，TRITC标记山羊抗小鼠-IgG（1∶400）37 ℃孵育1.5 h，PBS漂洗5 min×3次，加GFAP抗体（1∶500），以等量的抗体稀释液作为对照，37 ℃湿盒孵育4 h后PBS漂洗5 min×3次，FITC标记山羊抗兔IgG（1∶400）37 ℃湿盒孵育1 h后Hoechst（终浓度为1 μg/mL）染细胞核5 min；漂洗封片后荧光显微镜观察、照相。
1.5 细胞计数
在显微镜下随机选取20个视野，分别计数发蓝光的细胞核数量（表示细胞总数），GFAP阳性细胞数（绿光）和NF200阳性细胞数（红光），算出平均每个视野中GFAP阳性细胞所占细胞总数的比例。
2 结果
脊髓AST原代培养时，细胞悬液接种后贴壁较快，12 h时绝大部分细胞都已贴壁，部分细胞已长出细小的突起，24 h后胞体发出许多长而分支的突起，胞体较大、胞质较丰富、形状不规则。3 d后数量增加显著，逐步形成网络状连接。培养10 d后，细胞基本长满培养瓶壁。传代后细胞生长更活跃，培养7 d便可长满瓶壁，很快融合成片状。
NF200抗体染色全为阴性，提示培养盖片中不含神经元。GFAP阳性染色发绿色荧光，Hoechst染核为蓝色荧光。染色结果显示：AST形状不规则，核较大、呈圆形或椭圆形，常偏向一侧，多数细胞突起数量较多且粗短（图1），对照盖片中没有阳性染色。细胞计数结果显示：仅4.2%的细胞核没有被GFAP着色，提示AST纯度可达95.8%以上。
A:GFAP阳性染色呈绿色荧光；B:Hoechst染核呈蓝色荧光；C:A、B重叠；:示未被GFAP着色的细胞；标尺:50 μm
图1 AST免疫细胞化学染色
3 讨论
星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多、分布最广的胶质细胞，传统理论认为它对神经元具有绝缘、营养、保护和支持作用。后来，又发现它在中枢神经系统损伤和修复中也具有重要的作用，一方面星形胶质细胞可合成神经营养因子，促进神经再生［5］；另一方面又合成神经生长抑制因子，如硫酸软骨素蛋白多糖等［6］，抑制神经再生，尤其是损伤恢复后期形成星胶瘢痕被认为是神经再生的机械性障碍。近年，AST参与突触发生、发育日益受到学者们的重视，被看作是继突触前、后成分之后构成突触的第三成分［1］。而离体培养是一种较好的研究细胞形态、功能以及神经生物学和神经药物学等的重要方法。因此，有关星形胶质细胞培养的文献很多，但多数是培养大脑皮质的AST培养或细胞株培养，有关脊髓AST培养的资料较少，尤其是其纯化方法和培养纯度的测定报道更为少见。
获得较为单一的、高纯度的细胞成分是进行深入研究的基础，因在体AST与其他种类细胞混杂存在，无法完全分离，故高纯度的AST只能通过体外细胞培养来获得，且必须对培养的AST进行纯化方可获得。AST体外培养及纯化常采用植块培养法和分离细胞培养法。前者应用较早，一般以中枢神经系统的白质组织作为植块，但该培养法的最大弊端是难以得到高纯度的AST，现已很少采用；而后者应用较为广泛。本研究参照McCarthy的方法［4］，并加以改良，在换液时将培养液吸干，使培养细胞暴露于空气中10秒钟，可以除去其中的少突胶质细胞，因后者在空气中很短时间内即会死亡。同时，当AST铺满培养瓶壁时，因AST贴壁紧密，经37 ℃、280 r/min摇18 h后倒去培养液并用新鲜培养液漂洗3次，可进一步纯化所得的AST。此外，选用新生大鼠也有利于获得高纯度的AST，因为AST的分裂高峰发生在动物胚胎晚期及出生以后［7］，故一般选择出生以后的新生动物［8］。原代培养时接种细胞的密度可能会与AST的纯化程度有关，一般在原代培养时采用相对较低的接种密度，因神经元不再分裂增殖，且传代后大多会死去。
免疫细胞化学技术是鉴定细胞类型的可靠手段。NF200是神经元的分子标志物，本研究中，所有培养盖片均为阴性，说明其中不存在神经元。GFAP存在于胶质原纤维中间丝中，且它仅存在于星形胶质细胞中，是鉴定星形胶质细胞的特异性标志物［9］，本研究中阳性染色发绿色荧光，实验中有95.8%细胞染色阳性，提示AST所占比例可能还要高于这一比例，因为受免疫细胞化学方法局限性的影响，如固定时细胞破裂导致仅有细胞核残留、染色深浅等，实际纯度可能还要高。Hoechst为染核的荧光染料，能显示培养盖片上的所有细胞核，便于计数细胞总数。总之，本研究所用方法能很好地培养和纯化AST，且具有简单、高效的优点。
【参考文献】
［1］ Araque A, Parpura V, Sanzgiri RP, et al. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partern［J］. Trends Neurosci, 1999,22(5):208-215.
［2］ Tournell CE, Bergstrom RA, Ferreira A. Progesterone-induced agrin expression in astrocytes modulates glia-neuron interactions leading to synapse formation［J］. Neuroscience, 2006,141(3):1327-1338.
［3］ Elmariah SB, Hughes EG, Oh EJ, et al. Neurotrophin signaling among neurons and glia during formation of tripartite synapses［J］. Neuron Glia Biol, 2005,1:1-11.
［4］ McCarthy KD, de Vellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue［J］. J Cell Biol, 1980,85(3):890-902.
［5］ Krenz NR, Weaver LC. Nerve growth factor in glia and inflammatory cells of the injured rat spinal cord［J］. J Neurochem, 2000,74(2):730-739.
［6］ Lemons ML, Howland DR, Anderson DK. Chondroitin sulfate proteoglycan immunoreactivity increases following spinal cord injury and transplantation［J］. Exp Neurol, 1999,160(1):51-65.
［7］ Barbin G, Selak I, Manthorpe M, et al. Use of central neuronal cultures for the detection of neuronotrophic agents［J］. Neuroscience, 1984,12(1):33-43.
［8］ Imura T, Kornblum HI, Sofroniew MV. The predominant neural stem cell isolated from postnatal and adult forebrain but not early embryonic forebrain expresses GFAP［J］. J Neurosci, 2003,23(7):2824-2832.
［9］ Horiuchi M, Tomooka Y. An attempt to generate neurons from an astrocyte progenitor cell line FBD-104［J］. Neurosci Res, 2005,53(2):104-115.
作者单位：（1.第三军医大学基础医学部神经生物学教研室，重庆 400038；2.成都医学院：a.病理学教研室；b.组织胚胎与神经生物学教研室，四川 成都 610081）