稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定

【摘要】  目的筛选出稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECVp50，为研究dyneindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础。方法将构建的pRep50质粒稳定转染至ECV304细胞，通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。结果经间接免疫荧光染色和免疫印迹实验验证，稳定过表达p50基因的细胞克隆株命名为ECVp50。结论成功建立了稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECVp50，为后续研究积累了有价值的实验资料。

【关键词】  病毒；微管骨架；逆行性运输；过表达；p50

Construction and appreciation of p50 gene cells stable overexpression

    CHEN Wei, GAO Na, WANG Jiali, ZHANG Junlei, TIAN Yanping, AN Jing  (Department of Microbiology, College of  Basic Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

    Abstract: Objective To construct stable p50 gene overexpression cells for studying the role of dyneindynactin in the retrograde transport of Dengue virus. Methods ECV304 cells were stable transfected by pRep50. Then the stable p50 gene overexpression cells were confirmed by western blot and indirect immunofluorescence assay. Results The stable p50 gene overexpression cells were selected and identified，named ECVp50. Conclusion The stable p50 gene overexpression cells have been constructed successful, which lays a base for further study on roles of p50 in virus infection.

    Keywords: virus；microtubules；retrograde transport；overexpression；p50

    病毒感染宿主细胞必须经过吸附到宿主细胞表面、穿入细胞质或内含体、脱壳、早期病毒蛋白合成、基因组复制、晚期病毒蛋白合成、病毒组装/成熟、释放几个步骤，这实际上是一个病毒与宿主细胞相互作用的过程。为了有效地感染宿主细胞，病毒必须进入宿主细胞，到达细胞内的特定区域才能启动并完成自我复制。目前研究证实，病毒主要利用宿主细胞骨架系统或膜运输系统完成其在细胞内的移行。细胞骨架系统由微丝、微管、中间纤维及其摩托蛋白（motor protein）组成。当病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行时，运输的动力则来自两类摩托蛋白：胞质动力蛋白（cytoplasmic dynein）和驱动蛋白（kinesin）。它们分别介导病毒和病毒蛋白从细胞周边向细胞核方向的逆行性运输，以及从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输［1］。研究显示，多数情况下胞质动力蛋白需要有dynactin复合体的辅助，二者相连形成的dyneindynactin复合体在逆行性运输过程中起了关键作用［2］。dynactin复合体至少由9种蛋白组成，包括Arp1、p50、actincapping protein等［3］，有文献报道过量表达p50将会使dyneindynactin复合体的功能受到影响，进而影响到病毒的逆行性运输。登革病毒是否也利用微管骨架在dyneindynactin复合体指导下完成逆行性运输，目前尚未见文献报道。为了研究dyneindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用，本研究将构建的真核表达质粒pRep50稳定转染至ECV304细胞后，经筛选得到细胞克隆株，为进一步的实验研究奠定工作基础。

    1材料与方法 

    1.1实验材料和主要试剂

    ECV304细胞、真核表达质粒pReceiverM01a和pRep50由本室保存，转染采用美国Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂质体转染试剂，小鼠抗p50单克隆抗体购自BD公司，羊抗小鼠IgGFITC、小鼠抗βactin单克隆抗体和G418购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司。

    1.2稳定过表达p50基因细胞株的建立

    ECV304细胞用含10%新生小牛血清（fatal calf serum，FCS）的DMEM培养基于37 ℃，5%CO2孵箱内培养。转染前1 d，将对数生长期的ECV304细胞以2×103个/孔接种96孔细胞培养板，于24 h以内、细胞融合达80%～90%时将pReceiverM01a与pRedyn质粒转染细胞，pReceiverM01a作为对照（根据说明书步骤操作）。将96孔细胞培养板的1孔细胞传代至6孔细胞培养板的2孔，稀释约150倍，操作时注意避免胰酶过分消化细胞，吹打细胞应轻柔，每孔中加入2 mL含10%FCS的DMEM，37 ℃孵育48 h，以使细胞表达足够量的抗性酶。以含1 mg/mL G418和10% FCS的DMEM 2 mL替换6孔细胞培养板中的培养液，进行筛选，时间约为1周，其间以含G418的培养基换液一次。待镜下观察到有成团的单个细胞克隆生长后，胰酶局部消化，将每个单克隆细胞分别转入24孔细胞培养板培养，仍保持G418筛选压力，但G418浓度降为0.5 mg/mL。细胞长至70%～80％融合时，传代细胞扩大培养，G418浓度保持0.5 mg/mL。得到的稳定表达pReceiverM01a与pRep50质粒的ECV304细胞株，分别命名为ECVpRe和ECVp50。

    1.3间接免疫荧光染色

    将盖玻片置于6孔板中，将ECV304、ECVpRe和ECVp50细胞悬液（2×105个/孔）接种于6孔培养板中的盖玻片上，37 ℃，5%CO2孵育18～24 h。取出细胞爬片，PBS漂洗2～3遍，4%多聚甲醛室温固定20 min。PBS漂洗后，0.2%Triton X100/PBS室温通透5 min。PBS漂洗后，加1%BSA/PBS室温对非特异性位点封闭1 h后加小鼠抗p50单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。PBS漂洗3～5遍，加入FITC标记的羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h，漂洗、干燥后40%甘油封片，荧光显微镜下观察，并拍照。

    1.4免疫印迹

    将ECV304、ECVpRe和ECVp50细胞悬液（2×105个/孔）接种于6孔培养板中，37 ℃，5%CO2孵育18～24 h。PBS洗涤1次，加入2×SDS上样缓冲液50 μL，使用细胞刮子将细胞从6孔细胞培养板底部剥离，吸入1.5 mL离心管中，沸水浴5 min，取15 μL上样电泳，配制10%分离胶，5%积层胶，行SDSPAGE。电泳结束后，采用半干转印仪，以15 V恒压转印30 min，将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上。NC膜以含5%脱脂奶粉的TTBS室温封闭2 h；参照蛋白Marker的位置，将p50和βactin所在部分的NC膜剪开，分别与p50鼠单抗（工作浓度为1∶250）、鼠抗βactin单抗（工作浓度为1∶2 000）4 ℃反应过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（工作浓度为1∶1 000）室温反应1 h；以缓冲液TTBS洗涤膜3次，每次10 min。将膜放入显色底物溶液，DAB显色10～30 min，用ddH2O洗膜，终止反应，观察并拍照。

    2结果

    2.1免疫荧光染色

    经筛选得到的p50过表达的单克隆ECV304细胞株（ECVp50）、空质粒对照细胞株（ECVpRe）及ECV304细胞进行了间接免疫荧光染色，结果显示，与对照ECVpRe和ECV304相比，ECVp50细胞内的特异性荧光明显增强（图1）。

    2.2免疫印迹 

    将ECVp50、ECVpRe及ECV304细胞进行了免疫印迹，结果显示，与对照ECVpRe和ECV304相比，ECVp50细胞中的p50蛋白的含量明显增加（图2）。

    3讨论

    病毒具有严格的细胞寄生性，病毒感染宿主细胞，必须经过吸附、穿入/脱壳、大分子生物合成及组装、释放这样一个完整的复制周期。已知真核细胞中充满的细胞器和由微丝、微管、中间纤维组成的细胞骨架，限制分子量大于500 kD分子的自由扩散，若不借助细胞的运输体系，病毒颗粒难于通过粘滞的、半流体的细胞质到达特定目的地。因此只有在宿主细胞内某种运输体系的参与下，病毒运动才能保持一定的目的性和方向性。大量实验证明，病毒颗粒的分布与微管骨架关系密切，病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行。

    微管（microtubule，MT）广泛存在于各种真核细胞中，与维持细胞形态、细胞运动、细胞分裂有关。微管以靠近核周的微管组织中心（microtubule organizing center，MTOC）为“－”端，向外周呈辐射状分布。研究表明，微管与病毒和病毒蛋白的胞内运输有关［46］，为运输物质提供轨道并对运输方向具有指导作用，而运输的动力则来自作为摩托蛋白的胞质动力蛋白和驱动蛋白。胞质动力蛋白由2条重链、2条中等链、2条轻中等链和数目可变的轻链组成，ATP和微管结合区域位于重链，而运输货物的特异性与中等链和轻链有关。胞质动力蛋白介导从细胞周边向细胞中心的逆行性运输，驱动蛋白介导从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输。近年来，大量研究显示胞质动力蛋白需要有Dynactin复合体的辅助，dynein的中等链与dynactin相结合，形成dyneindynactin复合体，在逆行性运输过程中发挥关键作用。dynactin复合体至少由9种蛋白组成，p50是dynactin复合体中含量居第2位的亚组分，过量表达p50使dyneindynactin复合体的功能受到影响，进而影响到病毒的逆行性运输。Suikkanen等［7］的实验显示，过量表达p50使dyneindynactin复合体的功能受到影响，使大量的病毒颗粒不能运输到微管组织中心区域而弥散在细胞质中。Aspasia Ploubidonz等［8］在痘苗病毒的研究中亦得到了类似的结果。

    登革病毒（dengue viruses，DV）是黄病毒属（Flavivirus）的单股正链RNA病毒，引起人类登革热（classical dengue fever，DF）和登革出血热/登革休克综合征（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/DSS）［9-11］。目前，关于登革病毒与靶细胞相互作用的分子机制尚不十分清楚，登革病毒是否也利用微管骨架在dyneindynactin复合体指导下完成逆行性运输，尚未见文献报道。因而，为了研究dyneindynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用，本研究将构建的真核表达质粒pRep50稳定转染至ECV304细胞后，经筛选得到细胞克隆株，通过间接免疫荧光法和免疫印迹检测，结果显示稳定表达细胞株中的p50蛋白表达明显上调。由此可见，本实验成功构建了稳定过表达p50基因的细胞株ECVp50，为进一步的研究奠定了基础。

【参考文献】
  ［1］ Chen W, Gao N, Wang JL, et al. Vimentin is required for dengue virus serotype 2 infection but microtubules are not necessary for this process［J］. Arch Virol, 2008, 153(9):1777-1781.

［2］ HammAlvarez SF, Sheetz MP. Microtubuledependent vesicle transport: modulation of channel and transporter activity in liver and kidney［J］. Physiol Rev. 1998, 78(4):1109-1129.

［3］ Dohner K, Wolfstein A, Prank U, et al. Function of dynein and dynactin in herpes simplex virus capsid transport［J］. Mol Bio Cell, 2002, 13(8):2795-2809.

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［5］ Sodeik B, Ebersold MW, Helenius A. Microtubulemediated transport of Incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus［J］.J Cell Biol, 1997, 136(5):1007-1021.

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［7］ Suikkanen S, Aaltonen T, Nevalainen M, et al. Exploitation of microtubule cytoskeleton and dynein during parvoviral traffic toward the nucleus［J］. J Virol, 2003, 77(19):10270-10279.

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［10］ Zhang JL, Wang JL, Gao N, et al. Upregulated expression of beta3 integrin induced by dengue virus serotype 2 infection associated with virus entry into human dermal microvascular endothelial cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 356(3):763-768.

［11］ 冯嘉瑜，张艮甫.器官移植中的基因治疗［J］.局解手术学杂志，2004，13（2）：124-125.

作者单位：1.第三军医大学基础医学部微生物学教研室，重庆市微生物工程实验室，重庆 400038；2.第三军医大学基础医学部组织胚胎学教研室，重庆 400038；3.首都医科大学基础医学院微生物学教研室，北京 100069