体细胞核移植与iPS细胞研究的对比分析

【关键词】  SCNT技术;诱导多能干细胞;iPSC

　近年来，利用体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术建立各种生物的胚胎干细胞系获得一定的成果，但尚存在一些问题[1]。有研究认为：随着诱导多能干细胞(induced p luripotent stem cells,iPSC)研究日新月异的进展，其优势日益突出，直接重编程有望取代SCNT等技术而成为获取胚胎干细胞的主要方式[2]。SCNT技术究竟存在哪些问题和限制?直接重编程技术本身又存在什么样的问题?下面就这几个问题综述如下。

　　1 SCNT和iPS细胞的历史回顾

　　1996年通过SCNT技术获得了克隆羊多莉，这项研究证明了已经高度分化的哺乳动物细胞核，可以在去核卵细胞内“去分化”重编程至多能性状态[23]。由于采用SCNT技术得到的细胞在体外可以发育成囊胚，而囊胚阶段的细胞是具有全能性的，具有分化为多种组织细胞的功能。这一成果让科学家们发现了SCNT技术在临床上的巨大应用前景。1998年Thomason等[2]采用人工授精的方式，取体外发育到约一周龄的胚胎，建立了5株能在体外培养中长期传代的胚胎干细胞系。由于胚胎干细胞(ESC)在分化功能上的全能性，这项突破为体外诱导干细胞分化获得各种不同的细胞、组织、器官提供了可能性 ,因而在多种疾病比如癌症、帕金森综合症以及糖尿病的治疗上，有巨大的应用前景。这个消息引起世界范围内的强烈关注，带动了生命科学界干细胞工程研究的广泛热潮。然而，当两个研究小组将他们研究结果发表于Nature和Science杂志时，立即引来世界舆论的一片哗然，批评之声不绝于耳。ESC引起的伦理问题，法律问题掀起了之后干细胞研究领域多年的争执不休，很多国家明令禁止有关人类胚胎干细胞方面的研究，严重阻碍了干细胞研究的发展。但这两项技术成果无疑带给科学家新的提示和思路，伦理学和法律问题的限制迫使科学家们寻找新的切入点，在体细胞重编程方面历经重重磨难，终于迎来了iPSC的产生。

　　2006年利用体外转染技术，筛选出4个转录因子Oct3/4，Sox2，Klf4和 cMyc，在逆转录病毒的介导下导入到小鼠表皮成纤维细胞(MEFs)中，使其成功诱导为干细胞样的细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似，只是在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导多能干细胞[24]。随后独立建立了人类iPS细胞系。iPS细胞由于突破了SCNT技术的诸多限制，掀起了继1998年世界范围内追捧ESC之后的又一狂潮，大大推动了iPS细胞研究的发展，使得近两年来，iPS细胞的发展日新月异，iPS细胞本身存在的问题有所突破，与临床特异性疾病的关系也步步接近[45]。

　　2 SCNT存在的问题

　　2.1 伦理学问题

　　SCNT技术曾引起称为“世界伦理之争”的大争论，焦点主要在于克隆人的潜在危险性。对于克隆人，社会存在的担忧主要有:①如何承认克隆人的社会地位，克隆人有着和我们同样的生存权利，利用克隆人用于人类疾病治疗违背伦理;②克隆是一种无性生殖，打破了人类精卵结合的生殖方式，以低级生殖方式代替高级生殖方式是反自然的;③克隆没有经过基因重组等遗传方式，从进化的角度看提高了种群对疾病的易感性，对种群的生存不利。SCNT带来的治疗性克隆在临床治疗方面带给人类的希望是无穷无尽的，但是治疗性克隆和生殖性克隆有着相同的起点和技术基础，稍有不慎，SCNT就将深陷于人类克隆这一伦理问题。随之而来的伦理学和法律问题在很大程度上限制了SCNT技术的广泛开展和应用。

　　2.2 人卵细胞来源和遗传疾病问题

　　在多利羊产生的过程中，从多只羊体内取出277个卵细胞，只产生了29个可用胚胎，其中只有3个胚胎活到了出生，1个胚胎活到了成年，也就是“多利羊”。如果SCNT用于人类胚胎干细胞的研究，如此大量的人卵细胞如何得来?早期科学家获得人卵细胞主要靠妇女捐赠，但女性卵细胞个数有限，正常情况下每个妇女每月排出一个成熟卵细胞，一生中排出卵细胞在400～500个，每个妇女平均每次捐赠的卵细胞个数为10～12个。另一方面，获取卵细胞的手术也具有一定的风险，这也成为很多妇女不愿意接受卵细胞捐赠手术。因此，人卵细胞的获取一直是一个问题。为弥补人类卵细胞的不足，科学家试图利用哺乳动物卵细胞代替人卵细胞，但同样面临两个问题：①人卵细胞和哺乳动物卵细胞细胞质的差异，SCNT技术中细胞质成分对重编程的启动具有重要作用，这种差异会不会导致重编程过程的紊乱和失败，将人细胞核植入兔子的卵细胞中获得了胚胎干细胞，但重复试验再也得不到相同的结果，说明这种杂交方式具有不稳定性[5];②人类细胞的细胞核与动物卵细胞经过重编程获得的ESC同样具有不可避免的伦理学问题。

　　2.3 技术复杂度和效率问题

　　SCNT技术过程中，从卵细胞获取到体外去核、成熟、细胞核移植、融合、激活、重构胚的体外培养和胚胎移植，均涉及复杂的技术条件，并且任一步的失误将影响到整个克隆胚胎的发育。另外，利用SCNT技术获取成熟个体效率较低，在青蛙和小鼠的核移植实验中，获得成熟个体的效率均不超过1%～2%。并且，核移植过程的效率受供体细胞等多方面影响，供体细胞核分化程度越高，获得成熟个体的效率就越低。SCNT技术由于各方面的限制，决定了其在干细胞研究和临床应用方面显得力不从心。而与SCNT技术相比，iPS细胞具有以下优势:①在伦理学限制上优于SCNT，在获取iPS细胞的过程中，细胞直接重编程至多能性状态，不再涉及摧毁胚胎以及生殖性克隆这一难题，因此伦理和法律也为其敞开大门;②供体细胞来源广泛，比如小鼠成纤维细胞、肝细胞、胃细胞、B淋巴细胞、胰岛β细胞、神经干细胞等[6];③技术相对简单，更适用于大规模细胞的获取。SCNT由于技术复杂，只有少数实验室可以进行，而iPS细胞的获取流程和技术要求相对较低，很多实验室均可以开展相关方面的研究[78]。

　　3 iPS细胞存在的问题

　　3.1 效率问题

　　无论是小鼠还是人类，无论采用何种细胞类型、选用何种组织形式的转录因子，其iPS细胞的转导效率极低，大部分不超过1%，如此低的转导效率无疑会限制iPS细胞在临床方面的应用。为了提高转导效率，科学家们尝试着不同的策略和方法。有作者采用6个因子(Oct4,Nanog,Sox2,Lin28,cMyc和Klf4)的组合成功诱导体细胞产生iPS细胞，并且效率比单用4因子提高10.4倍。有作者通过补充附加基因或生物活性分子如SV40T抗原能明显提高重编程效率高达70倍。研究发现组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丙戊酸(VPA)，可以使4因子重编程iPS细胞效率提高100倍左右，同时也可使3因子(除去cMyc) 重编程效率提高约50倍。研究发现抑癌基因p53的小干扰RNA(siRNA)同UTF1一起可以使iPS细胞的转导效率提高100倍，并且没有致癌性。干扰p53信号途径可以显著提高转导效率，通过敲除或下调p53及其靶基因p21的表达等方式，可以提高转导效率上百倍，转导效率可达10%[9]。

　　3.2 安全问题

　　iPS细胞获取过程中的另一重大缺点在于致癌风险的潜在威胁。这种威胁的来源有:①病毒整合性外源性转录因子的导入，会提高插入突变致癌的风险。有作者为几种iPS细胞系插入位点进行分析，发现插入位点各不相同，这种随机插入的方式很可能改变其他基因的表达，从而带来不可逆转的后果。②原癌基因cMyc的掺入会提高致瘤性，有作者报道：导入cMyc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%。从安全方面考虑，利用腺病毒短暂性表达Oct3/4,Sox2,Klf4和cMyc4个转录因子而无需整合到宿主细胞基因组的方法，诱导获得了小鼠iPS细胞，利用质粒作为载体同样获得了iPS细胞[10]。最近，先体外获取四个转录因子编码的蛋白，然后同VPA一起导入到成纤维细胞中，获得了小鼠iPS细胞[11]。这种加入小分子蛋白质获取iPS细胞的办法由于避免了插入突变等致癌风险，有可能成未来获取iPS细胞的新方向。

　　以上论述了SCNT技术存在的种种问题，阐述了iPS细胞相对于SCNT技术的种种优势，其在效率和安全性方面存在的问题在将来的研究中还有待进一步的提高和保证，只有这样，利用体外重编程技术获得iPS细胞才有足够用于临床的资本。根据最近iPS细胞的发展趋势尤其是在特异性疾病模型方面的进展来看，或许直接重编程获取iPS细胞已经具备代替SCNT技术获取胚胎干细胞的能力。但是对于是否放弃SCNT技术的研究，科学家们有更深的见解，他们认为：如果我们能够弄清楚卵细胞如何有效地启动细胞核重编程，其分子机制的阐明对于提高iPS细胞的转导效率可能很有帮助。

【参考文献】
  　[1] Campbell KH,McWhir J,Ritchie WA,et al.Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line[J].Nature,1996,380(6569):64-66.

　　[2] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

　　[3] Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M，et al.Induction pluripotent stem cells from adult human fibroblast by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

　　[4] Yu J,Vodyanik MA,SmugaOtto K,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J].Science，2007,318(5858)：1917-1920.

　　[5] Kim JB,Zaehres H,Wu GM,et al.Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors[J].Nature,2008,454(7204)：646-650.

　　[6] Aasen T, Raya A, Barrero MJ, et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes[J].Nat Biotechnol，2008,26(11):1276-1284.

　　[7] Amabile G,Meissner A.Induced pluripotent stem cells:current progress and potential for regenerative medicine[J]. Trends in Molecular Medicine,2009,15(2):59-68.

　　[8] Zhao Y,Yin X,Deng H,et al.Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation[J].Cell Stem Cell,2008, 3(5):475-479.

　　[9] Takahashi K,Aoi T,Yamanaka S.Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53p21 pathway[J].Nature,2009,460(7259):1132-1135.

　　[10] Yu J,Hu K,SmugaOtto K,et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences[J].Science,2009,324(5928):797-801.

　　[11] Zhou H,Wu S,Joo JY,et al.Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4(5):381-384.