CD20阳性反应细胞在人胎回肠的发育

【摘要】  目的 探讨CD20免疫反应阳性细胞在人胎回肠的分布、定位及发育。方法 收集因故终止妊娠人胎回肠30例，采用形态学及免疫组织化学SP法染色显示CD20免疫反应阳性B细胞，用BioMias 29图像分析系统对免疫反应阳性细胞进行计数，有关数据作统计学分析。结果 12周胎龄，回肠壁间充质内出现CD20阳性反应细胞，单个散在分布，数量少。14周胎龄，可见CD20阳性反应细胞染色深，反应增强。16周胎龄，CD20阳性细胞散在或成群分布于绒毛中轴或深部结缔组织内。18周胎龄，CD20阳性反应细胞聚集形成淋巴小结。24周后，CD20阳性反应细胞数量明显增多，大量细胞参与构成集合淋巴小结。结论 人胎回肠B淋巴细胞发育过程中，12周开始表达CD20分子。随胎龄增加，CD20阳性反应细胞数量逐渐增多，参与构成淋巴小结。

【关键词】  胎儿;回肠;CD20阳性细胞;发育

　Abstract: Objective To study the distribution, location and development of CD20positive immunoreaction cells in human fetal ileum. Methods Totally 30 samples of human fetal ileums were collected. CD20positive immunoreaction cells were displayed by immunohistochemical ultrasensitiveSP method and morphology. The immunoreactive positivecells were counted by BioMias 29 photograph analysis software and analyzed by statistics software. Results At the 12th gestational week (g.w), there were a few CD20positive immunoreaction cells, distributed singlely in the mesenchyme of the ileal wall. At the 14th g.w, the response intensity of CD20positive cells was increased. At the 16th g.w，CD20positive cells were distributed diffusely or gathered together in the villus central axis or in the deep connective tissue of mucosa. At the 24th g.w，the numbers of CD20positive cells were increased distinctly and lymphoid nodules were formed. ConclusionThe expressions of CD20 molecule began at the 12th g.w during the development of B lymphocytes in human fetal ileum. The CD20positive immunoreaction cells were increased with the growing of fetal age and began to participate in the forming of lymphoid nodules.

　　Keywords: fetus; ileum; CD20positivecell; development

　　B淋巴细胞是构成回肠壁淋巴组织的重要成分，CD20分子是一种磷酸化蛋白质分子，相对分子质量为33 000～37 000，是B淋巴细胞表面分化抗原，主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，在免疫系统中起重要作用，常被用作鉴定B细胞的标记[1]。目前能够特异性识别CD20阳性B淋巴细胞的单克隆抗体研制成功，这使得应用免疫组织化学方法研究B淋巴细胞在人胎回肠淋巴组织中的定位、分布和发育成为可能[24]。以往关于人胎回肠的研究主要涉及组织发生、集合淋巴小结的发育等方面，而对人胎淋巴细胞个体发育，特别是回肠CD20阳性B淋巴细胞发育的研究报道较少[5]，因此，本实验采用免疫组化法研究不同发育阶段正常人胎回肠内CD20阳性B淋巴细胞的动态变化规律，以期为人胎适时免疫的建立和疾病防治等相关研究提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集贵阳市各医院因故终止妊娠的人胎30例。鼠抗人CD20单克隆抗体(mouse monoclonal antibody antihuman CD20)来源于福州迈新生物技术开发公司，SP免疫组化染色试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人胎胎龄计算

　　所有人胎标本均测量顶臀长(crownrump length，CRL),按Patten标准确定胎龄：9～12周5例,CRL为39.0～79.0 mm;13～16周7例，CRL为91.0～137.0 mm;17～20周6例，CRL为147.0～185.0 mm;21～24周6例，CRL为197.0～230.0 mm;25～28周6例，CRL为240.0～270.0 mm。

　　1.2.2 取材、制片和染色

　　各例均取回肠，用10%Formalin固定，经乙醇梯度脱水，透明，石蜡包埋，4 μm连续切片、贴片，染色。免疫组织化学SP染色显示CD20阳性细胞。主要步骤如下：切片脱蜡下行入水，PBS洗3 min×3，热抗原修复10 min，试剂A室温10 min，PBS洗3 min×3，试剂B室温下10 min，一抗(CD20，1∶100)4 ℃过夜，PBS洗5 min×3，试剂C室温10 min，PBS洗3 min ×3，试剂D室温下10 min，PBS洗3 min×3，DABH2O2液显色，中性树胶封片。

　　1.2.3 细胞计数和统计学处理

　　各胎龄段标本随机取非连续切片5张，应用BioMias 29图像分析系统进行检测，在高倍镜下(物镜40倍)每张切片随机取3个视野，分别计数每个视野内的CD20阳性细胞数。所有数据以均数±标准差(±s)表示，并采用统计软件SPSS 11.5进行分析。

　　2 结果

　　2.1 CD20阳性细胞的分布和定位

　　12周胎龄，回肠壁间充质内出现CD20阳性反应细胞，散在分布，反应较弱，数量少(图1a)。14周可见CD20阳性细胞染色深，呈强阳性反应。16周胎龄，CD20阳性细胞数量增多，散在或成群分布于绒毛中轴或深部结缔组织内(图1b)。18周胎龄，CD20阳性反应细胞聚集成群，形成明显的淋巴小结(图1c)。24周后，CD20阳性反应细胞数量明显增多，大量细胞参与构成集合淋巴小结，部分细胞散在分布于结缔组织内(图1d)。a：12周，回肠壁CD20阳性细胞单个分布，×400;b：16周，回肠壁CD20阳性细胞分布于绒毛中轴，×400;c：18周，回肠壁CD20阳性细胞数量增多，聚集形成淋巴小结雏形，×400;d：24周，回肠壁CD20阳性细胞聚集形成集合淋巴小结，×100　图1 不同胎龄人胎回肠壁CD20阳性细胞分布(SP免疫组化染色)

　　2.2 CD20阳性细胞计数

　　各胎龄回肠组织切片CD20阳性反应细胞计数经统计分析结果见表1。9～12周与13～16周比较，细胞数量无显著性差异(P>0.05)。13～16周以后，随胎龄增长，CD20阳性反应细胞数量逐渐增加(P<0.05)，尤以25～28周细胞数量最多，与21～24周相比P<0.01。表1 各胎龄CD20阳性细胞计数

　　3 讨论

　　肠道是机体内最大的免疫器官之一，其免疫诱导部位包括肠集合淋巴小结、孤立淋巴小结和阑尾。其中回肠因有丰富的集合淋巴小结和散在分布的淋巴组织而在消化道免疫中占据极其重要的地位，成为消化道免疫的研究热点。回肠肠壁内淋巴细胞作为肠道相关淋巴组织中的一个特殊组成部分,是机体免疫系统与外来抗原以及微生物较早接触的免疫细胞,同时也是较早发生免疫反应的细胞,其通过分泌一些细胞因子，诱导肠粘膜免疫应答。因此，回肠内淋巴细胞的类型、数量以及分布可以反映回肠局部粘膜免疫屏障的建立情况及其免疫防御功能的完善程度。

　　有研究证实，B淋巴细胞的发育过程最早由胎儿肝脏开始，在人胚中,曾于7.5周的肝内发现有免疫球蛋白合成的最早表现[6]。但B淋巴细胞在人胚胎时期何时迁移进入回肠内，未见报道。CD20是是存在于所有B细胞特异性抗原,CD20通过参与组成钙离子通道对B细胞的分化和成熟进行调控,同时它还通过细胞内的酪氨酸激酶信号转导途径对细胞周期进行调控。这种磷酸化蛋白质分子，主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化，在免疫系统中起重要作用。CD20首先在前B细胞中表达，成熟的B细胞也表达CD20，CD20阳性反应细胞参与构成淋巴小结。B细胞激活和处于生长进化的B细胞均有CD20高表达。B细胞向浆细胞分化时，CD20的表达呈下降趋势，在浆细胞中不表达。有证据表明，CD20阳性B细胞具有强大的抗原提呈细胞功能[78]。本研究显示人胚胎回肠12周开始表达CD20分子，随胎龄增加，CD20阳性反应细胞数量逐渐增多，尤以28周最为明显。证实了12周胎龄的回肠内已有B淋巴细胞迁入，胎儿免疫功能已开始建立。

　　从血液内进入回肠壁粘膜并主要位于结缔组织内的B淋巴细胞最终将发育分化为浆细胞，浆细胞是B淋巴细胞的终末效应细胞,具有合成和分泌抗体的重要功能。许多研究证实,消化管粘膜是免疫系统中产生抗体的重要效应部位。有人曾预测未来的疫苗主要经肠道免疫,原因是肠壁为机体最大的免疫器官,粘膜产生的抗体远远多于体液中的抗体[9]，本研究结果支持这一预测。此外,人的消化管淋巴细胞形态学计量结果也证实,盲肠和回肠的淋巴组织密度在消化管中最大,尤其回肠是消化管最主要的免疫功能部位。CD20阳性细胞在回肠的分布亦如此。随着胎儿的出生及进食，肠道中的B细胞将发育分化为浆细胞，因为肠道是食物等外来抗原接触机会较多、时间较长的部位,故浆细胞在肠道分布较为集中。此外,回肠中含有丰富的淋巴组织,尤其在孤立和集合淋巴小结中B细胞数量较多,也提示回肠具有浆细胞产生的巨大潜力。

【参考文献】
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　　[6] 李 红，苏 敏，胡 蓉，等.人胎肠系膜淋巴结组织发生及相关T、B细胞的发育[J].解剖学杂志,2009,32(2):183-186.

　　[7] Donauer J. The blood group incompatible living kidney transplantation[J]. MMW Fortschr Med, 2007,149(3132):27-28.

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