点击显示 收起
关键词 细胞凋亡 脐血CD34 + 细胞 Caspase-3 人参皂甙
Effects of ginsenosides Rg1and Rb1 on the
apoptosis of CD34 + cells isolated from umbilical cordal blood
Guo Ruolin，Wan Xiaohua，Chen Xiaojian，et al.
Tianjin Hospital，Tianjin300211.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of ginsenosides Rg1and Rb1during umbilical cordal blood hematopoietic cells apoptosis induced by growth factors withdrawal.Methods Human umbilical cordal blood CD34 + stem cells were purified and obtained steriley.CD34 + cells were cultured in StemSpan TM SFEM serum-free medium containing cytokines TPO（50μg/L）and SCF（50μg/L）for7days.Then cells were collected and maintained in the same medium with the growth factors deprivation for24h and72h.The experimental groups were respectively treated with Rg1or Rb1with different concentrations.FITC-Annmexin-V/PI flow cyloanalyzer and Caspase-3colorimetˉric assay were respectively used to determine cell apoptosis rate and the activity of Caspase-3.Results 24hours afˉter the cytokines withdrawal，the apoptosis rate in control cells was（24.79±2.80）%;the apoptosis rate in Rg1（2.5 mg/L，5mg/L，10mg/L）groups were（12.35±2.07）%，（11.87±1.20）%and（13.91±0.50）%（P<0.01）;in Rb1groups（5mg/L，10mg/L）were（17.88±0.65）%，（20.61±0.85%）（P<0.01）respectively.24hours and72hours after cytokines deprivation，Caspase-3activities in control groups were taken as1.00，the values in Rg1-2.5group were0.72±0.09and0.57±0.22（P<0.01），in Rg1-5group were0.51±0.11and0.42±0.10（P<0.01），in Rg1-10group were0.63±0.06（P<0.01）and0.83±0.12（P>0.05）;in Rb1-5group were0.54±0.18and0.32±0.18（P<0.01），in Rbl-10group were0.87±0.07（P>0.05），0.55±0.03（P<0.01）.Conclusion These results demonstrated that apoptosis induced by growth factors withdrawal of umbilical cordal blood hematopoietic cells can be inhibited by Rg1and Rb1and this effect was involved with Caspase-3signal pathway.
Key words apoptosis umbilical cordal blood CD34 + cells caspase-3 ginsenosides
细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序的一种主动性的死亡过程，它涉及细胞内一系列的信号转导和调控过程。在造血过程中，细胞凋亡在调控细胞增殖、分化的平衡中起重要作用。人参“补气养血”的功效虽然已经在临床上应用已久，但机理并未阐明。近年来对人参的主要成分人参皂甙的研究很多，多集中在促进 ˇ 基金项目:天津市科委自然科学基金资助项目（编号:013608511）造血祖细胞增殖，诱导髓性白血病细胞凋亡，增强机体免疫功能等方面。国内学者研究发现人参皂甙不但能促进造血干/祖细胞增殖，并且能诱导定向分化 ［1］ 。但人参皂甙Rg1和Rb1对造血干细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究观察了人参皂甙Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的脐血造血细胞凋亡的拮抗作用，以期在细胞水平上为人参皂甙“补气养血”功效的作用机制提供更多的实验室证据。
1 材料与方法
1.1 标本来源 脐血采自天津医科大学第二附属医院和天津市中心妇产科医院，无菌条件下采集正常足月分娩的胎儿脐带血，母亲和新生儿均应健康，肝素抗凝。采集后4h内用相对密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞（MNC），洗涤，计数备用。
1.2 CD34 + 细胞的分离及纯度分析 利用德国Miltenyi Biotec公司CD34 + 细胞单克隆抗体免疫磁珠分离系统（MACS）分离富集CD34 + 细胞备用。分离方法依试剂盒说明书进行。流式细胞仪检测CD34 + 细胞纯度:取纯化后细胞3×10 4 加入10μl FITC-CD34荧光抗体，阴性对照为FITC-IgG荧光抗体（BD公司产品），用FACScan（BDIS公司）流式细胞仪分析，结果用LysisⅡ软件处理。
1.3 CD34 + 细胞液体培养扩增 取24孔板，StemSpan TM SFEM无血清液体培养基建立1ml/孔培养体系，CD34 + 细胞5×10 4 个/孔，每孔加入细胞因子TPO50μg/L、SCF50μg/L，置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中，培养7天。收集细胞，PBS洗涤2遍后悬浮于MACS缓冲液中，台盼蓝染色计数细胞总数。
1.4 人参皂甙Rg1和Rb1撤除细胞因子引起脐血细胞凋亡的干预作用 24孔板中，取扩增7天后脐血细胞5×10 4 个/孔，1ml/孔，撤因子组不加任何细胞因子;人参皂甙干预组加入不同浓度的Rg1（2.5mg/L、5mg/L、10mg/L），分别设为Rg1-2.5组，Rg1-5组，Rg1-10组;不用浓度的Rb1（5mg/L、10mg/L），分别设为Rb1-5组，Rb1-10组，混匀，撤因子组设6个复孔，其他每组设3个复孔。置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中，分别取培养24h和72h的适量细胞，以备用于细胞凋亡检测。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 撤除细胞因子培养24h后，各取1×10 6 个细胞，PBS洗涤，并用1×Binding Buffer（试剂盒中提供）使浓度为1×10 6 个/ml;转移1×10 5 个细胞（100μl）到5ml流式专用管，另取等量3管细胞做对照管;实验管加入5μl FITC-Annexin-Ⅴ和5μl PI，3个对照管:（1）只加5μl FITC-Annexin-Ⅴ;（2）只加5μl PI;（3）两者都不加;混匀，25℃避光孵育15～30min;各管加入400μl1×Bindˉing Buffer，1h之内用流式细胞仪CellQuest软件分析，观察Annexin V + /PI - 早期凋亡细胞群，检测细胞凋亡率。
1.6 Caspase-3活性测定 撤除细胞因子培养24h、72h后，取1×10 5 个细胞，洗涤，加100μl细胞裂解液;冰浴10min，离心10000×g，1min，移上清入另一新管，取出20μl以测总蛋白值;其余上清移入96孔酶标，加入50μl细胞裂解液，50μl2×反应缓冲液工作液，5作者： 郭若霖 万晓华 陈晓建 谈志龙 王学谦 2005-9-22