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【摘要】 目的 选择适宜的呼吸道标本，以方便呼吸道感染非细菌性病原体病原学诊断应用。方法 采集呼吸道感染患者的鼻咽分泌物（NPS）、痰和支气管肺泡灌洗液（BLF）为检测标本，应用聚合酶链反应技术（PCR）检测腺病毒（ADV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、肺炎衣原体（CP）和肺炎支原体（MP）4种非细菌性病原体，比较这3种呼吸道标本检测病原体结果的差异。结果 ADV、RSV、CP和MP的检出率，NPS标本分别为10.4%、29.2%、33.3%和18.8%，痰标本分别为10.4%、25.0%、35.4%和16.7%，BLF标本分别为8.3%、22.9%、27.1%和16.7%。上呼吸道感染和下呼吸道感染时，不同标本检测病原体的阳性率有一定的差别。结论 NPS、痰和BLF均可用做PCR检测呼吸道感染非细菌性病原体的标本，其中NPS容易获得、采集安全、能够满足病原学诊断需要，可以作为首选标本。
关键词 呼吸道感染 病原学 检测 标本
The comparison on the results of non-bacterial pathogens in three respiratory specimens from the patients with respiratory infection
Yang Linying，Chen Yu，Xue Chengyan.
Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde067000.
【Abstract】 Objective To choose the suitable respiratory specimens for the detecting of non-bacterial pathogens to facilitate the diagnosis of the etiology in acute respiratory infection（ARI）.Methods Nasopharyngeal seˉcretion（NPS），sputum and bronchoalveolar lavage fluid（BLF）were collected from the patients with ARI and make these three specimens for detecting of Adenovirus（ADV），Respiratory syncytial virus（RSV），Chlamydia pneumonia（CP）and Mycoplasma pneumaonia（MP）by polymerase chain reaction（PCR）to find the pneumonia（CP）and Myˉcoplasma pneumonia（MP）by PCR to find the differences of results of detecting the three specimens.Results The positive rates of ADV，RSV，CP and MP were10.4%，29.2%，33.3%and18.8%in NPS;In sputum the rates were10.4%，25.0%，35.4%and16.7%;In BLF，the positive rates were8.3%，22.9%，27.1%and16.7%respecˉtively.The positive rates had some difference in different samples for detecting in AURI and ADRI.The differences on the positive results of same pathogens were no statistics meaning among NPS，sputum and BLF（P>0.05）.Concluˉsion NPS，BLF and sputum can all be used as specimens for detecting of non-bacterial pathogens by PCR in ARI and NPS may be the first choice for its advantage such as obtainable，safety for collect and can satisfied the clinical need of diagnosis of etiology.
Key words respiratory infection etiology diagnosis specimens
呼吸道感染是临床最常见的、对健康有较大损害的疾病之一，其致病病原体的种类多、有季节和地区的流行性的差异、不同病原体对药物的敏感性各异，因此检测呼吸道感染病原体是对呼吸道感染进行病因学诊断和制定确切治疗措施的决策性依据之一 ［1，2］ 。控制和治疗呼吸道感染的最佳时机是感染早期，但常规检测方法敏感性较低、周期较长、尤其对非细菌性微生物的检测很困难，不能满足临床早期诊断和治疗的需要。聚合酶链反应技术（PCR）在检测各种微生物方面具有很好的应用价值 ［3～5］ ，应用PCR进行呼吸道感染病原学早期诊断的关键环节之一是选用合适的标本，因标本因素导致PCR检测失败的例子并不少见。因此，在应用PCR进行呼吸道感染病原学检测时，对标本因素应引起足够的重视。选择适宜的标本，才能保证病原学诊断质量。
1 材料与方法
1.1 标本 呼吸道感染患者48例，其中以上呼吸道感染为主要表现者26例、以下呼吸道和肺部症状为主要表现者22例。采集同一患者鼻咽分泌物（NPS）、痰和支气管肺泡灌洗液（BLF）为检测标本，各48份。（1）采集NPS:用高压消毒的棉拭子在咽部进行涂拭，获取NPS。（2）采集痰标本:用高压消毒的痰盒留取深部痰液，获得痰标本。（3）采集BLF:进行支气管镜检查时，用输液用生理盐水做支气管肺泡灌洗，吸取灌洗液置于经高压的消毒的Eppendoef管中，获得BLF。标本如暂时不能检测，应及时处理后于-20℃条件密封保存。
1.2 方法 应用PCR检测腺病毒（adenovirus，ADV）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virrs，RSV）、肺炎衣原体（chlamydia pneumonia，CP）和肺炎支原体（mycoplama pneumoˉnia，MP）。检测此4种病原体的PCR试剂为正规商品药盒。
1.2.1 标本处理 （1）处理NPS:在拭子套管中加入2ml经高压消毒的生理盐水，将NPS拭子浸入生理盐水中，在混旋仪上混旋洗涤NPS拭子5min，将NPS洗涤液移入1.5ml Epˉpendoef管中，15000rpm离心5min，用移液器移取大部分上清，留取约200μl包括管底沉淀物的洗涤液备用。（2）处理痰标本:向痰盒内加入约痰标本量2倍体积的蛋白酶K消化液，尽可能混匀，于52℃放置60min，再转移至1.5ml Epˉpendoef管中，15000rpm离心5min，取上清备用。（3）处理BLF:将BLF移入1.5ml Eppendoef管中，15000rpm离心5min，用移液器移弃大部分上清，留取约200μl包括管底沉淀物的洗涤液备用。
1.2.2 PCR操作 取100μl标本处理液，提取RSV模板;再取100μl标本处理液，提取ADV、CP和MP模板。按试剂盒操作说明进行模板提取、PCR反应体系制备、PCR扩增、扩增产物电泳、溴化乙啶染色等操作步骤。
1.2.3 结果判断 在PCR扩增产物紫外检测仪中观测经溴化乙啶染色后的电泳条带，以出现与阳性对照（试剂盒提供）齐同的核酸条带判断读为阳性结果。
2 结果
各种呼吸道标本应用PCR检测病原体的结果，如表1所示。
表1 三种呼吸道标本应用PCR检测病原体的阳性结果（略）
结果显示，呼吸道感染时，病原体的总体阳性检测结果以NPS最高、痰标本次之、BLF最低;其中，上呼吸道感染为主要症状时，病原体的阳性检测结果以NPS最高、痰标本次之，BLF最低;下呼吸道感染为主要症状时，病原体的阳性检则结果以BLF最高、痰标本次之、NPS最低。
3 讨论
呼吸道感染病原学检测结果是指导诊治呼吸道感染的依据，PCR技术在呼吸道感染病原学检测方面具有很高的应用价值，尤其对培养较困难的微生物，可以应用PCR技术方便、快捷地进行检测 ［3～5］ 。虽然PCR技术对检测标本的要求较低，但针对某一特定的疾病，由于病原体存在的部位不同，需要采集有病原体存在的标本，才可能检测到阳性结果。就呼吸道感染而言，病原体感染后，一般首先定植在鼻咽部位的粘膜上皮细胞中，并在鼻咽部位的粘膜上皮细胞中进行复制增殖等生物学过程，此时在病原体及其代谢产物的作用下可产生上呼吸道感染症状。然后，病原体再向下呼吸道、肺泡等部位移植，产生下呼吸道、肺泡感染症状 ［1，2］ 。因此，进行呼吸道感染病学检测时，应根据病情发展情况选择适宜的病原学检测标本。研究结果显示，应用PCR技术在NPS、痰和BLF3种呼吸道标本中均可以检测到ADV、RSV、CP和MP阳性结果，其中，在上呼吸道感染组，病原体的检测阳性率以NPS最高、痰标本其次，BLF最低;在下呼吸道感染组，病原体的检测阳性率以BLF最高、痰标本其次、NPS最低。提示，在呼吸道感染的不同时期，病原体主要存在部位将发生不同的变化，应根据这种特点采集合适的病原学检测标本:（1）NPS标本采集简便、安全、易得，在反映呼吸道感染早期病原学方面有较高的优势和难以取代的地位，但对下呼吸道和肺泡感染的病原体的敏感性较差 ［1，2］ ;（2）BLF标本可以客观的反映下呼吸道和肺泡感染的病原体情况，但此方法具有一定风险、对患者具有一定的痛苦、需特殊设备且操作较复杂、费用较高等制约因素 ［1，2］ ，不便于普遍和常规开展;（3）痰标本能比较客观和全面地反映呼吸道感染性疾病的病原体，较易获得且采集方便安全，但对呼吸道感染早期病原学诊断的敏感性较差 ［1，2］，患者无痰的情况也比较多见，此时可考虑应用NPS或BLF标本。
研究表明，在应用PCR技术进行呼吸道感染病原学检测时，应依据病情状况和临床表现采用不同的检测标本;对以上呼吸道症状为主要表现的患者，尤其在呼吸道感染早期，应首选NPS为检测标本;对以下呼吸道症状为主要表现的患者，应首选BLF标本，考虑到进行支气管镜操作具有一定制约因素，也可以首先选择痰标本进行病原学检测，必要时再行支气管镜操作采集BLF标本。
参考文献
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4 薛承岩.临床早期诊断急性呼吸道感染多病原体的方法.承德医学院学报，2000，17（3）:64-66.
5 薛承岩，刘霞，刘李承.急性呼吸道感染多病原体的临床病原学早期诊断.中国医师杂志，2001，3（11）:824-825.
（收稿日期:2004-07-26）
（编辑莫 茗）
作者单位:067000河北省承德医学院附属医院