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【摘要】 目的 探讨在6P21.3的PPPIRl0基因鼻咽癌发生的作用。方法 采用肿瘤相关基因确定候选基因，用黄金分割优选法，采取根据类似疾病（肿瘤）的相关基因来确定候选基因，用PCR扩增引物片段，预变性，根据条件设计DNA片段分析系统（DHPLC）有关参数进行自行运行检测，从而找出鼻咽癌易感基因的位点。27例原发性鼻咽癌和正常人对照外周血标本189例，进行了检测。结果 在6P21.3TNFa/至微卫星标记D6P1640之间基因，用PCR方法扩增分布于候选基因中10个片段含有编码区SNPs序列，DHPLC检出511个杂合子，证实该片段杂合子为一个新的位点，可能为鼻咽癌易感基因。结论 通过基因定位所限定的候选基因内部或附近的SNPs进行相连性研究，成为预测复杂性、多基因疾病性质、原因及易感性的有效方法。
关键词 鼻咽肿瘤 易感基因 单核苷酸多态性
Study on SNPs and susceptibility gene of NPC
Yao Liangquan，Li Xin，Guo Yuehua，et al.
Department of Surgery，Shenzhen TCM Hospital Affiliated to Guangzhou Uniuersity of TCM，Shenzhen518033.
【Abstract】 Objective To investigate the correlation between PPPIR10gene at6P21.3and nasopharyngeal carcinoma（NPC）.Methods The candidate genes were determined from cancer-related genes with golden section optimum selection method.The genes were amplified by PCR and the products were analyzed by high-porformance liquid chromatography（DHPLC）to find the site of susceptibility gene of NPC.The blood samples from27patients with NPC and189healthy subjects were analyzed.Results At6P21.3from D6P1640，10fragments which contained sinˉgle nucleotide polymorp
hisms（SNPs）were amplified by PCR，511heterozygeus were found by DHPLC.These fragˉments were confirmed to be new sites which could be susceptibility gene of NPC.Conclusion The correlation study between condidate gene and SNPs is one of effective methods to forecast the cause，feature and susceptibility of the compler polysenes diseases.
Key words nasopharyngeal neoplasms susceptibility gene single nucleotide polymorphisms
鼻咽癌（Nasophqryneal Caranona，NPC）是一种见于我国南方的复杂性或多基因性疾病，有明显的地域性和家族集聚现象，世界80%病例发生在我国南方与东南亚地区，有基因组不稳的特性 ［1］ ，其后代发病率有不同程度下降，显示遗传与环境因素共同影响着鼻咽癌的发病，统计学资料表明，6%～10%的鼻咽癌患者有癌家族史 ［2］ ，因此，鼻咽癌遗传易感性可能是发病的一个重要因素。近年来，应用候选基因—SNPs—易感基因（Cankidate gene-SNPs-Susceptibility gene）技术路线，对一些疾病相关的候选基因或者通过基因定位所限定的候选基因内部或附近的SNPs进行相连性研究，成为揭示复杂性或多基因疾病性质原因及易感性的有效方法，我们对单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorˉplism SNP）高度多态性标志的应用，对疾病相关位点准确定位，初步发现一个位于6P21.3的PPPIRl0基因15110位的新SNP位点，是鼻咽癌相对风险对照组的3.5倍（COR=3.5，P<0.01;95%CI=1.53～7.99）。因此，我们在此位进行了进一步研究。
1 对象与方法
1.1 对象 所有病例均为1998～2003年在第一军医大学与深圳市中医院手术的鼻咽癌患者，活检组织及其配对的外周血样品病例必须未经化疗处理，经病理证实为鼻咽癌，所有外周血淋巴细胞经环孢霉素处理和EB病毒转化，永生化的家系淋巴细胞在含15%的小牛血清的1640培养基，5%的CO 2 、37℃条件下培养。
1.2 候选基因提取 采取肿瘤相关基因确定候选基因，用黄金分割优选法，采取根据类似疾病（肿瘤）的相关基因来确定候选基因，在6P21.3区域PPPIRl0基因邻近区域（+200Kbp）选择相对重要候选基因，然后根据研究分析结果，再比较其它候选基因。从NCBI的dpSNP库进行在线搜索，结合NCBI和dpSNP Hapmap库跟踪和检索，确定候选基因的功能性SNPs，分析SNP位点。
1.3 引物及方法 通过引物（Primer）5.0软件或者在线引物软件，设计各SNP位点的PCR反应物，扩增片段为200-500db，由上海细胞新赛尔生物技术公司合成，分别在各标本检测管，加入2×PCR Master Mix，上下游引流，模板，纯水，95℃预变性。PCR仪内95℃40s，50℃～54℃40s，72℃30s，35次循环，72℃延伸。
1.4 功能性SNP的选择、检测 在dbSNP库筛选的SNPs主要针对功能性的SNPs，首先选择基因外显子编码区的SNP，然后选择基因上游（2000bp范围内）调的SNP。样本经PCR扩增后，产物预变性根据条件设置DNA片断分析系统（DHPLC）有关参数，进行自行运行检测。
1.5 标本DNA抽提 按照《分子克隆》实验指南，全血加入红细胞裂解液，涡旋30s，10000g离心1min。弃红色上清，重复上述步骤至沉淀为白色或弱红色为止。加入DNA抽提裂解液和蛋白酶K，55℃水浴过液;加入等体积Tris饱和酚:氯仿（1∶1），混匀，12000g离心，12min移去上清，重复2次;加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀沉淀丝团状DNA，离心回收DNA，TE-20℃保存。
2 结果
单核苷酸多态性（SNP）是指基因内特定核苷酸位置上存在二种不同的碱基，其中最少一个在群体中的频率不少于1%、位于蛋白质编码区和位于表达调控序列中的SNP在功能或致病方面具有更重要的意义 ［3］ 。通过对该区域中SNP的病例对照分析有可能阐明这类SNP与异常表型之间的关系，从而有关于对疾病发生发展机制的阐明，人们越来越相信基因组中的这类多态性有助于解释个体的表型差异，不同群体和个体对疾病，特别是复杂性多基因性疾病的易感性。因此，寻找不同疾病相关的SNP引起科学工作者极大关注。
本研究经生物信息方法分析6P21.3TNFa至微卫星标记，D6S1624之间基因，用PCR方法扩增分布于候选 基因中10个片段含有编码区SNPs序列，包括NPC外周血，对照外周血标本189份，DHPLC检出511个杂合子，证实该片段杂合子为一个新的位点，内含子中的A-G转移，理应不影响蛋白序列和结构，见表1。但根据基因连锁原理，我们推测可能为NPC易感基因。
针对6P21.3区域的研究是从近年开始的。1974年Siˉmons等报道鼻咽癌的发生与HLA抗原有关 ［4］ 。1983年，Chan ［5］ 等发现中国人鼻咽癌患者与HLA的部分特定单位型有密切关系，如A2、B46和A33、B58。因此，认为该区域应有可能存在有鼻咽癌的疾病易感基因，该设想在1990年被Lu ［6］ 等的研究推进一大步。在Nature上他们报道了他们的成果，通过中国华南、香港、新加坡华人鼻咽癌的易感基因位于6号染色体短臂的MHC（Major-histocompatibility-Complex）区内或附近区域，且显示该易感基因具有隐性遗传特征。1997年Ooi ［7］ 等人通过重点筛查整个6P21.3MHC的微卫星标记D6S273，D6S276，D6S1624与TNFa，HLA-A，BDR基因位点，最后确认该基因位于HLAI类和HLAⅢ类基因编码序列之间，与D6S1624紧密相连，但大量的鼻咽癌等位基因杂合性丢失调查和最近的比较基因组杂合扫描研究均显示6P区域没有大片段缺失。因此小片段缺失，突变单核苷酸多态性（SNPs）改变存在可能性较大。
表1 蛋白序列和结构基因片段 NPC组略
3 讨论
单核苷酸多态性（SNP）是指基因内特定核苷酸位置上存在二种不同的碱基，其中最少一个在群体中的频率不少于1%。位于蛋白质编码区和位于表达调控序列中的SNP在功能或致病方面具有更重要的意义 ［7］ 。通过对该区域中SNP的病例对照分析有可能阐明这类SNP与异常表型之间的关系，从而有关于对疾病发生发展机理的阐明，人们越来 越相信基因组中的这类多态性有助于解释个体的表型差异，不同群体和个体对疾病，特别是复杂性多基因性疾病的易感性。因此，寻找不同疾病相关的SNP引起科学工作者极大关注。鼻咽癌是一种复杂性多基因性疾病，其发病机制是一个多步骤、多因素、多基因参与的过程，由于鼻咽癌明显的家族聚集性，因此研究鼻咽癌的病因不仅要从患者的生活、环境、饮食习惯、EB病毒感染情况方面进行，同时还应从鼻咽癌遗传易感性方面进行研究。因此，有关鼻咽癌易感基因定位与鼻咽癌遗传易感基因研究对进一步阐明鼻咽癌病因显得十分重要。单核苷酸多态性，尤其是位于蛋白编码区的SNPs和位于表达控序的SNP在功能和致病方面具有重要意义。SNP发生的类型、频率具有种族、地域差异，这种差异是否与不同民族、不同个体对疾病易感性不同有关有待探讨。经研究分析6p21.3TNFa至微卫星标记，D6S1624基因间所得候选基因中10个片段含有编码区SNPs序列，证实该片段杂合子为一个新的位点，可能是鼻咽癌的易感基因。
SNP是基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换和单碱基的插入/缺乏。基因组中大约平均每1000bp就有一个SNP。SNP两个形式存在:（1）基因编码区（Coding region）的功能变异;（2）遍布于整个基因组的非编码区（调控区，内含子和剪接连接区）的单核苷酸变异。SNP作为第三代遗传标记不仅用于致病基因的搜寻和进化，种群多样性研究，更重要的是，SNP尤其 是cSNP与人类各种遗传性特征相关。因此，探讨SNP是诊断学和治疗学上的革命。
参考文献
1 Li GY，Yao KT，Ronald G.Sistte chromatid exchange，1989，43（4）:613-618.
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6 Ooi EE.Association between micrsatellites within the human MHC and nasopharygealcarcinoma.Cancer，1997，74:229-232.
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基金项目:2004年国家自然科学基金资助项目（编号:30371535）
作者单位:1 518033广东广州中医药大学附属深圳市中医院
2 510515广东广州南方医科大学肿瘤研究所
（收稿日期:2004-09-07） （编辑田 雨）