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随着临床输血事业的发展，血小板（platelet，PLT）的使用日益广泛。但是，随着大量使用血小板的情况出现，血小板输注无效成为困扰临床医生的大问题，即反复输血者可能产生的血小板相关抗体及输血小板无效（refractoriness to platelet transfusion，RPT）。一般情况下，把监控血小板输注结果常用的公式，即校正计数增值（CCI）和血小板回收率作为判别依据，当输注后1h CCI<7.5和20h CCI<4.5或1h回收率<20%，则认为血小板输注无效。血小板输注无效有非同种免疫因素和同种免疫因素，非同种免疫因素包括血小板质量、发热感染、弥漫性血管内凝血（disseminated in-travascular coagulation，DIC）、骨髓移植、脾肿大等因素，另一方面，血小板上由于存在血小板相关抗原，主要是人类白细胞抗原（HLA）Ⅰ类抗原，和血小板特异性抗原即人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）。目前，HPA被国际正式命名的有22个抗原，其中12个抗原被列入6个遗传系统，分别命名为HPA-1～5和HPA-15。这些抗原产生的同种免疫可导致RPT的发生。研究证实血小板相关抗体中79.9%为HLA抗体，HLA抗体与血小板抗体共存占17.6%，血小板特异性抗体占2.7% ［1］ 。国外对血小板输注无效的预防、处理、抗体实验评估及应用有相当多的讨论 ［2～4］ 。血小板相关抗体常出现在血小板输注6次以上的患者中，有报道称反复大量的输注血小板可导致50%左右患者产生同种免疫抗体，相当于红细胞同种抗体产生频率的几十倍。血小板相关抗体引起的新生儿免疫性血小板减少症（neonatal alloimmune thrombocytopenia，NAIT）也不时有病例报道，其主要因素是人类PLT抗原抗体反应，但Saito ［5］ 却发现了1年中3例HLA抗体引起的NAIT。Kiefel ［6］ 等研究发现输血患者的血小板同种异型抗体特异性与NAIT或输血后紫癜患者所观察到的明显不同。我国目前去白细胞血液成分的使用还不普遍，对血小板抗体检测的普及程度还很低，对血小板相关抗体引起的疾病还不够重视。因此，对血小板抗体研究必然会成为引人注目的课题，同时也可以与临床输血事业的发展相适应。
1 抗体检测方法
常用的几种方法中，淋巴细胞毒试验（lymphocyte cyto-toxicity test，LCT）多用于分析单独的HLA抗体，而对于HLA及HPA混合抗体一般采用另外的方法:酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、被动混合血凝试验（PMHA）或固相分析、血小板单克隆特异性抗体固定试验（monoclonal antibody-specific immobilization of platelet anti-gens，MAIPA）等等，据报道这几种方法都比LCT方法更灵敏，34%血清在ELISA中有反应而LCT阴性 ［7］ 。血小板凝集试验也在某些实验室用于检测HPA-2抗体。抗-HPA-1b和抗-HPA-5b出现的频率远多得多，人们发现HPA-5b抗体单独出现常比其他HPA抗体特异性出现的多。Kiefel等 ［6］ 在多次输血的患者中发现了多例HPA特异性抗体。
1.1 LCT 很多实验室用LCT来筛检HLA-Ⅰ类抗体，因为这一实验所需的血清和淋巴细胞量少，既便宜又方便，可用来处理大量的样本，但其也存在一些缺陷。用LCT方法，一般使用18～60株不等的型特异性已知的细胞，谱细胞供者提供的淋巴细胞被保存在液氮中并仅在试验使用当天才被融化，也有实验室用60个O型供者混合细胞作筛查用，用于LCT的淋巴细胞的选择要重视以下的原则:（1）必须包含大多数WHO命名的抗原特异性的HLA-Ⅰ类抗原;（2）谱细胞必须能够鉴定血小板输注患者中出现频率高的HLA抗体并确定其特异性（主要是抗-A2，也有抗-A9，-B12或-B5）。Lee和Bierling ［8］ 用微量淋巴细胞毒试验（MLCT）和抗球蛋白增强MCLT两种方法检测HLA-Ⅰ类抗体，评估抗球蛋白增强MLCT在筛查和鉴定HLA-Ⅰ类抗体的作用，对145例多次输血的等待骨髓移植的恶性血液患者的血清样本和健康的骨髓供者的血清样本进行检测，结果抗球蛋白增强MLCT表现出了比MLCT更高的灵敏性（也更具特异性）;患者致敏后以及以后的一段相当长的时间里，抗球蛋白增强MCLT比MLCT更早检测到HLA-Ⅰ类抗体，MLCT从145例患者中检测出了14例（9.7%）有HLA-Ⅰ类抗体，而抗球蛋白增强MLCT从145例患者中检测出了19例（13.1%），更有甚者相同的血清样本用抗球蛋白增强MLCT方法检测出了另外的HLA-Ⅰ类特异性。而且抗球蛋白增强MLCT比MLCT提前了3～4天检测出了HLA 同种免疫的抗体。研究也显示，当抗球蛋白增强MLCT方法进行血小板交叉配血为阴性后可以得到满意的血小板输血后的计数提升，而用MLCT方法进行血小板交叉配血，观察到了血小板输注无效的发生。然而，在一些病例中，尽管用了抗球蛋白增强MLCT方法进行交叉配血为阴性，血小板输注后的计数提升还是比较低。
1.2 ELISA ELISA是经常用于检测HLA-Ⅰ类抗体的方法，虽然检测结果与其他方法可能存在不一致。总的来说，ELISA比MLCT更敏感，与抗球蛋白增强MLCT敏感性基本一致。这样的灵敏度可以鉴定刚产生HLA抗体的患者，也有足够的灵敏度检测输注不相容血小板后所存在的残余抗体。但用这种方法不能确定抗体的细胞毒性，比器官移植患者中检测所经常应用的流式细胞术的灵敏度稍差。在ELISA方法中，有的实验室使用了96孔包被有单个经提纯的包含有21个HLA-A特异性位点和45个HLA-B特异性位点的HLA抗原分子的微板来鉴别抗体特异性。ELISA方法是一个更精确检测HLA抗体特异性的方法，是由试验中抗体与包被子微板上的经过提纯的HLA抗原族结合的特异性而决定的。用这种方法，可以通过酶联抗人IgG（IgA或IgM）来检测存在或不存在IgG或IgM特异性抗体，另一个优点是非HLA自身抗体、抗胸腺球蛋白或任何其他针对淋巴细胞的抗体不会与包被了HLA抗原的微孔结合且很容易地排除掉。
1.3 MAIPA MAIPA方法广泛用于鉴定HPA抗体。其原理为鼠抗人HPA单克隆抗体与血小板孵育后与反应孔底固定的羊抗鼠抗体结合连接，洗涤加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后比色测定。此方法敏感度高、特异性较好，可以检测血小板上抗原数量很少的HPA-5抗原。当MAIPA方法用于筛查HPA抗体时，血清样本需与2～4份新鲜O型的HPA-1，3，5，Gov和CD36分型的纯合子血小板反应来进行检测（日本人应包括HPA-4），而去证实抗体特异性时细胞谱要相应的扩大。有人认为并非总要求全部需要纯合子，只有当HPA抗体无法确定时才需用纯合子来确证抗体特异性，有时为了鉴定HPA特异性抗体，除了患者的HPA定型以外，还可以用反向安排的谱细胞，如，HPA-1a1a3a3a对HPA-1b1b3b3b来进行检测，而HPA-2抗体的确定往往用血小板凝集试验来检测和确证 ［8］ 。Kiefel等 ［9］ 用MAIPA检测HLA抗体，不仅针对怀疑因免疫因素引起的血小板输注无效的患者，而且也在干细胞移植前进行常规检测。这种方法在检测血小板抗体和从总的血小板相关抗体及HPA抗体中区分血小板反应性HLA抗体方面非常灵敏。有些实验室中血清首先要经过流式细胞或荧光试验初步筛选，MAIPA方法仅用于初选阳性的血清的鉴定。由于MAIPA方法比较耗时，因此在紧急情况下可用ELISA方法来检测。
1.4 免疫荧光试验（immunofluorescence test，IFT） 该方法根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。在20世纪90年代中期Garner ［10］ 用淋巴细胞免疫荧光实验（lymphocyte immunofluorescence test，LIFT）在250例患者中检测HLA非细胞毒抗体，在这组患者中非细胞毒抗体出现的频率为30%，其中12%的患者LCT试验阴性;有时非细胞毒抗体先于细胞毒抗体产生，然而，尽管LCT阳性，LIFT仍是阴性。将LIFT列为常规筛检的第二种方法，是基于经济因素的限制和技术本身的缺点。悬浮血小板间接免疫荧光试验latelet suspension indi-rect immunofluorescence test，PSIFT）是一个比较灵敏的技术方法，用于对HPA抗体进行检测，但其特异性不够。例如当血小板表面由于存在多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定的抗体或与HLA-Ⅰ类抗原直接结合的抗体时，会检出假阳性反应 ［11］ 。因此，当得到阳性结果时，应把血清样本用非多聚甲醛固定的血小板系统地重复试验，并通过用单克隆抗体MAIPA试验直接检测血小板糖蛋白ⅡbⅢa、ⅠaⅡa、ⅠbⅨ、CD36和CD109。用PSIFT来筛查血小板HPA抗体，血清样本需要与至少3份新鲜O型的其HLA和HPA-1-3-5的型特异性是已知的血小板悬液反应，他们的CD36分子的表达也应是已知的。在欧美，由于HPA-5b抗体是频率高的抗体，所以至少要有1株细胞具有HPA-5b阳性分型。 1986年Rosenfeld和Bodensteiner发明了流式细胞（flow-cytometry）免疫荧光试验，克服了荧光显微镜的不敏感性。在这种分析方法中检测仪器不是荧光显微镜，检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞做荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各数据。流式细胞仪试剂常使用PE标记的鼠抗人IgG，PE标记小鼠IgG为同型对照，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗体的存在与否，该方法与MAIPA法有几乎相同的敏感性和特异性，主要用于抗体的活性检测与血小板交叉配型。但也有不足之处，即除非结合使用其他检测方法，否则对抗体阳性标本无法进一步确定是HLA抗体还是HPA抗体。
1.5 其他检测方法 被动混合血凝试验（passive mixed haemagglutination assay，PMHA）。PMHA方法主要用于HPA-2抗原抗体的检测，该方法允许用谱细胞快速检测样本，而谱细胞又能冰冻保存使用方便。另外，这也是一个灵敏的方法，可以通过用氯喹处理的固相化血小板来区分HLA和HPA抗体。Panzer等 ［12］ 用O型HPA-2a和-2b纯合的供血者获得的新鲜血小板进行血小板凝集试验用来确定HPA-2抗体特异性。微柱凝胶试验（microcolumn gel test，MGT）反应原理为传统的抗原抗体反应。如果血小板上结合了抗血小板抗体，则致敏在指示红细胞上的抗IgG与抗血小板抗体结合，滞留在凝胶介质中;反之，如果血小板未结合抗血小板抗体，则指示红细胞上的抗IgG不与血小板结合，离心后沉降于凝胶介质底部，生成的血小板抗原—血小板抗体—指示红细胞复合物通过凝胶这一“区分介质”与游离红细胞分开，而且凝胶还可将不同凝集程度的复合物区分开，形成可疑阳性（±）至4+的凝集。混合细胞黏附试验（固相技术）（mixed red cell adherence assay，solid-phase technique）为血小板与微孔中预先包被好 的单克隆抗血小板抗体反应，再与待检血清作用，洗涤，然后加入抗IgG包被的指示红细胞，根据指示红细胞的形态来判定结果。 简易致敏红细胞血小板血清学试验（simplified sensitized erythrocyte platelet serology assay，SEPSA）。血小板抗原固定于微孔壁上，与被检血清反应后以指示红细胞判定抗体存在与否，该方法适用于广泛的血小板抗体筛查，指示红细胞可以长期保存，使用较为方便。
2 抗体存在与输注无效之间的联系
要说明抗体与输注无效之间的关系，仍是各有各的说法。部分原因是由于各种非免疫因素可引起输注无效。大部分发生输注无效的个体是女性，可能因为怀孕而致敏。当输注了HLA和HPA相容的浓缩血小板后血小板计数得到了提升。总的来说，比较一致地认为，检测到的HLA和/或HPA抗体与血小板输注无效是相关的，Kurz等 ［13］ 认为在某些LCT试验中阴性但MAIPA方法阳性的HLA抗体影响血小板输注后的血小板计数增加。 资料表明有些输注无效的患者并不能证实有抗体存在。有少数患者在既没有检测到HLA也没有HPA抗体的情况下，输注了匹配的血小板后仍然没有计数的提升。这种情况可能是非免疫因素影响了输入的血小板的作用，也有可能存在有至今未明确的抗体而引起输注无效。还有的患者没有可检测的抗体，但在输注了匹配的血小板后计数得到了明显的提升，与这种结果有关的其科学性的及临床性的机制还不太清楚。 Lee ［14］ 等认为HPA和CD36抗体，不论单独还是一起与HLA抗体出现，都有临床意义，因为输注非相容的血小板后，都能观察到血小板计数提升很低或有输血后紫癜的发生。 Kekomaki ［15］ 的研究从另一方面证明了抗体与输注无效之间的关系。在芬兰由于对有同种免疫抗体产生的患者输注HLA和HPA匹配的血小板，大大降低了血小板输注无效的发生，临床证据支持了大量同种免疫性血小板输注无效患者用相容的血小板是成功的。
3 血小板供者选择
对于为有免疫性因素的患者挑选合适的血小板，有各种程序方法，Brand ［7］ 认为血小板的选择首先是基于HLA的配合和/或不存在跟患者抗体作用的抗原，或者通过测定相应的可以接受的抗原，接下来才通过交叉配血选择合适的血小板。在一些实验室进行上述程序后并不紧接着进行交叉配血，或者仅仅当没有匹配的血小板存在时才实行交叉配血。也有实验室直接通过交叉配血选择匹配的血小板。Navarrete ［8］ 认为血型相容的血小板要优于通过交叉配血挑选的血小板。
3.1 抗体特异性检测后的选择 为减少血小板输注无效和输血后紫癜的发生，所采取的对策可以是对患者进行血小板抗体筛选，然后根据检测出的抗体特异性来选择血小板供者，这样能暂时解决血小板输注无效的问题，但对于需长期输注的患者会产生另外的抗体。
3.2 交叉配血选择 虽然有证据表明血小板交叉配血与临床血小板输注疗效有显著相关性，但受限于技术的局限性，仍然有交叉配血阴性而发生血小板输注无效，同时也不能避免长期输注后的抗体产生的情况。3.3 基因型的匹配选择 在目前检出的22个HPA抗原中除HPA-14bw外均是由于单核苷酸突变而形成，称为单核苷酸多态性（SNP），因而可以运用PCR-SSP、PCR-RFLP、PCR-SSO等方法进行HPA分型。对于有HLA抗体的患者，可以选择HLA配合的血小板输注，而对于单独有HPA抗体或有混和抗体的患者，除了HLA是否配合，还需考虑HPA的配合问题。该选择方法可以为长期输血患者解决血小板输注无效的问题，因而建立HPA供者库在将来也许是必须的。
4 血小板输注策略
Kekomaki ［3］ 认为正确的血小板输注策略应当是:随机（去除白细胞）血小板;如产生临床输注无效;输HLA配合的血小板，并检测HLA抗体;如检测到HPA抗体，HLA配合的供者的HPA就需定型;对HLA配合的血小板输注无效就用HLA和HPA配合性的血小板。英国血液学标准委员会（British Committee for Standards in Haematology，BCSH）输血特别委员会（Blood Transfusion Task Force，BTTF）在血小板输注指南 ［16］ 中指出，如果在初始血清学筛选时检测到HLA抗体，应当输注HLA相合的血小板。如果来不及做血清学检查或筛选只做了LCT，特别当输注无效与出血有关时，也应当输注HLA相合的血小板。如果全面血清学检查没有发现HLA抗体，则不需输HLA相合血小板。此时应当进一步考虑是否存在非免疫因素，如果不存在，则应当进行HPA抗体检测。
5 展望
血小板输注无效目前在我国仍然是个问题，为存在免疫性因素的患者检测血小板抗体的最佳检测方法和为血小板输注无效患者选择最佳匹配血小板有着巨大的重要性。随着DNA序列的SNP技术的飞速发展，使得大数量人群的自动化，HPA基因定型在不久的将来将成为可能 ［17］ ，人们对血小板血型的研究将逐步深入和快速发展。现在国际上认为对血小板抗体检测的技术和分类方法尚有不足 ［18］ ，因此应为该领域技术的不断完善而继续探索。国内目前检测血小板抗体及血小板输注的重要操作程序的标准的缺乏是现实存在的，因此这个问题比在这一领域的具体研究还要急迫。
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（编辑建 伟）
作者单位:215007江苏苏州大学医学生物技术研究所
215006江苏省苏州市红十字中心血站