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【摘要】 目的 采用酶标记方法进行人卵泡刺激素（FSH）、绒毛膜促性腺激素（HCG）及催乳素（PRL）检测药盒的研制。 方法 采取抗人FSH、PRL及HCG单克隆抗体，同生物素/亲和素酶联免疫系统相结合，制备检测人血清FSH、PRL及HCG激素水平的ABC-ELISA检测药盒。 结论 灵敏度较常规的ELISA法提高了4～80倍，和同位素法（RIA）相比较差异无显著性。 结果 本试剂盒具有灵敏度高、对环境无污染等优点。
关键词 卵泡刺激素 催乳素 绒毛膜促性腺激素 ABC-ELISA检测药盒
卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、催乳素（prolactin，PRL）及绒毛膜促性腺激素（human chorionic go-nadotropin，HCG）是人体中重要的内分泌激素。内分泌功能障碍，可导致人体多种疾病的发生，因此准确的检测体内激素水平对诊断内分泌疾病有着重要意义。目前临床上广泛使用的检测手段为同位素法（radioimmunoassay，RIA），该方法具有灵敏度高、重复性好等优点，但仍存在需要昂贵的仪器、培养专业人员及对环境污染等问题。本实验室利用生物素/亲和素系统（Biotin-Avidin）标记单克隆抗体，制备了ABC-ELISA检测药盒，并与RIA法进行了比较性观察。
1 材料与方法
1.1 材料 FSH、PRL、HCG标准品购自SIGMA公司，单克隆抗体由本室制备，羟基琥珀酰亚胺脂生物素、亲和素-RP购自华美生物公司，常用生化试剂均购自本地。
1.2 方法
1.2.1 单克隆抗体的制备 本室采用的是脾免疫法制备单克隆抗体（McAb） ［1］ 。免疫动物为BALB/c小鼠。将抗原溶于生理盐水中，配制浓度为1μg/μl。乙醚麻醉小鼠，皮肤消毒后，打开腹腔暴露脾脏，在脾内注入4μl抗原，观察无活动性出血后关腹。于免疫的第3天眼球后取血，做免疫扩散实验，效价在64倍以上。摘除小鼠眼球放血，收集分离血清保存备用。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经克隆筛选出阳性细胞3株，亚单位分型IgG2株，IgM1株。将阳性细胞株分别注射到小鼠腹腔内扩大培养，并收集腹水，经A蛋白柱提取IgG，利用ELISA法测定效价，均可达1∶6400倍以上。
1.2.2 抗体的生物素化 （1）取羟基琥珀亚胺脂生物素40mg溶解于二甲基甲酰胺1ml中;（2）将提纯的单克隆抗体在浓度0.1mol/L、pH8.0、NaHCO 3 溶液中进行透析，蛋白浓度调节到10mg/ml;（3）取抗体1ml加入羟基琥珀亚胺脂生物素储存液50μl中搅拌均匀，室温放置2h;（4）在0.1mol/L、pH7.4的PBS缓冲液中透析过夜，保留抗体;（5）Sephadex G25凝胶过滤去除未结合的生物素;（6）加入等量的甘油，-20℃保存。
1.2.3 ABC药盒的检测方法 采用的是双抗体夹心法进行检测:（1）混合单克隆抗体1000倍稀释，包被苯乙烯检测板上4℃过夜;（2）0.1MPBS-T（吐温）洗3次，3min/次;（3）每孔加入血清样品100μl37℃保温1h;（4）0.1MPBS-T洗3次，3min/次;（5）0.6%明胶PBS100μl37℃封闭1h;（6）0.1M PBS-T洗3次，3min/次;（7）加入生物素标记的抗体100μl37℃保温1h;（8）0.1M PBS-T洗3次，3min/次;（9）加入亲和素-HRP100μl37℃保温1h;（10）0.1M PBS-T洗3次，3min/次;（11）POD显色10min，用0.2M H 2 SO 4 终止反应;（12）酶标检测仪490nm处读取数值，采用内插法计算含量。
2 结果
通过临床观察250例，FSH100例，PRL100例，HCG50例。采取同一份血清样品，同时采用两种检测方法（RIA法、ABC-ELISA法）做比较。其结果见表1～3、图1～3，两者差异无显著性，P<0.05。
表1 人FSH血清样品两种检测方法的比较 （略）
图1 人FSH血清样品两种检测方法的比较
表2 人PRL血清样品两种检测方法的比较 （略）
图2 人PRL血清样品两种检测方法的比较
表3 人HCG血清样品两种检测方法的比较 （略）
图3 人HCG血清样品两种检测方法的比较
3 讨论
近年来国外已有多篇报道，将高亲和力的生物素/亲和素系统同常规的ELISA方法相结合，在敏感性、特异性及快速性上都取得了较满意的结果。生物素/亲和素系统用于ELISA一般有三种形式，即桥联法（BAB）、标记法（BA）和ABC法，不少学者用之检测了不同的抗原—抗体系统均取得了较好的结果，其中以BA法和ABC法应用较多，敏感性一般比常规ELISA法高4～80倍。本实验室采用的是ABC法，将生物素直接标记在Ⅰ抗上，标记方法简单 ［2］ ，易掌握，生物素与抗体结合牢固。抗原～Bio-IGg～Avi-HRP直接检测方法，减少了Ⅱ抗这一中间环节，也就减少了一个非特异结合的因素。在原来的ELISA方法上加生物素/亲和素系统的放大效应使灵敏度提高一个百分点，检测水平接近RIA法，克服了同位素对环境的污染及需要昂贵的仪器设备等缺点，为尽早实现“绿色世界”计划、保护自然环境提供了一个好的检测方法。
参考文献
1 张洪雁.应用脾免疫法制备HCG单克隆抗体.中国生物制品学杂志，1996，6:1.
2 程云.生物素—抗生物素标记蛋白的制备及BA—ELISA建立和初步应用的研究.第四军医大学学报，1987，8（2）:80-85.
（编辑建 伟）
作者单位:130041吉林省计划生育科研所