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【摘要】 目的 研究和比较跨膜型肿瘤坏死因子-α（transmembrance TNF-α，mTNF）和分泌型TNF-α（secreted TNF-α，sTNF）对细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）功能的影响。 方法 采用单向混合淋巴细胞培养的方法，获取针对同种异体MHC分子的CTL。 结果 相同的刺激细胞经ConA刺激后作为靶细胞，成功建立了CTL实验模型;混合培养白细胞（mixed leukocyte culture，MLC），与靶细胞作用后，两型TNF-α均有表达:mTNF-α表达增加约2倍（P<0.05），sTNF-α增加3倍（P<0.05）;MLC与抗TNF-α抗体预先作用，再加入靶细胞，该抗体不能有效阻断其杀伤作用;相同剂量两型外源性TNF-α与MLC作用24h后，对MLC的杀伤作用不明显。 结论 两型外源性TNF-α对MLC作用差异无显著性。
关键词 跨膜型肿瘤坏死因子 分泌型肿瘤坏死因子 细胞毒T淋巴细胞
Effect of secreted and transmembrane tumor necrosis factor-αon the functions of human MLC
Gao Xiang，Xiong Shiqiu，Peng Yanwen
Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University，Guangzhou510080.
【Abstract】 Objective To study and compare the effect of mTNF-αand sTNF-αon the cytotoxic function of CTL.Methods CTL specific for allogenic MHC was taken by one-way mixed lymphocytes culture.Results Ex-perimental model of CTL used as target cells was succeeded stimulated by ConA.The two forms of TNF-αwere ex-pressed after the MLC reacted with their target cells.The mTNF-αelevated by2folds（P<0.05）vs sTNF-αele-vated by3folds（P<0.05）.After primed with the antibody of TNF-αand reacted with their target cells the anti-body could not block the cytotoxicity of MLC.MLC were challenged with the two forms of exogenous TNF-αin samedose.Conclusion The cytotoxic effect of the two forms of TNF-αon the MLC is inapparent.
Key words transmembrane TNF-α secreted TNF-α cytotoxic T lymphocytes
TNF-α是由激活的单核/巨噬细胞、细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）等分泌产生的一种重要的细胞因子。TNF-α分布广泛，几乎表达于所有正常及多种肿瘤细胞表面 ［1］ ，由此也决定了TNF-α广泛的生理活性。TNF-α有两种存在形式，即26kD的跨膜型和17kD的分泌型，前者为后者的前体 ［2］ 。CTL是机体细胞免疫应答中重要的效应细胞，它广泛地参与机体的抗肿瘤、抗病毒及胞内菌感染以及移植排斥反应等免疫过程。它有两个基本的细胞毒机制:通过胞吐作用分泌穿孔素颗粒酶等，直接对靶细胞进行杀伤，或是通过表达FasL、TNF等，与靶细胞表面相应的受体作用，诱导靶细胞凋亡或坏死 ［3］ 。目前国内外关于TNF-α对CTL作用的研究主要集中在TNF-α对CTL发育成熟的影响，关于TNF-α对活化的效应性CTL杀伤功能的研究则较少，而且这些研究几乎都是针对sTNF-α进行的。有关mTNF-α对效应性CTL细胞毒功能的影响则未见报道。本课题研究mTNF-α和sTNF-α对CTL细胞毒功能影响的异同，以期阐明跨膜型和分泌型TNF-α生物学特征及生物学作用的规律。根据临床需要，通过改变该细胞因子类型而对CTL功能进行调控，从而为临床治疗有关疾病提供新的线索及实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 RPMI1640干粉，DMEM干粉（GIBCO，美国）;淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）;胎牛血清及新生牛血清（杭州四季青）;丝裂霉素C（Kyowa，日本）;rhIL-2及ConA（Dif-co，美国）;TNF-α标准品（北京，邦定）;MTT（fluka，美国）;Triton X-100及颗粒酶底物NPAG（硝基酚乙酰基葡萄糖胺）（Amerisco，美国）;小鼠抗人CD3，CD4，CD8单克隆抗体（武汉生物制品研究所）;FITC标记的羊抗小鼠IgG，FITC标记的羊抗兔IgG及人肿瘤坏死因子酶联免疫试剂盒（博士德公司，美国）;凋亡检测试剂盒（Uomed公司，美国）;兔抗人TNF-α多克隆抗体（本室自备）;NIH3T3;表达mTNF-α的转基因NIH3T3（是本实验室已经建立好的mTNF-α的实验模型）。
1.2 方法
1.2.1 人MLC及其靶细胞的获取 ［4］ 常规分离获取两个无关个体的新鲜外周血中的外周血单核白细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），一份通过贴壁去掉单个核细胞，获取淋巴细胞，作为反应细胞，另一份PBMC中加入丝裂霉素C溶液，37℃温浴30min，作为刺激细胞。加入rhIL-2（10ng/ml），5%CO 2 37℃孵育7天，收获混合培养白细胞（mixed leukocyte culture，MLC），即为CTL的实验模型。同法获取提供刺激细胞的志愿者或无关个体第三志愿者的外周血单个核细胞，加入ConA溶液（2.5ng/ml），5%CO 2 37℃，孵育4天后，收获由ConA刺激转化的淋巴母细胞（ConA Blast）作为靶细胞。
1.2.2 流式细胞术检测淋巴细胞表面标志 包括CD3、CD4、CD8、mTNF-α的表达（方法从略）。
1.2.3 用ELISA法测sTNF-α（双抗体夹心法） 按产品说明书操作。
1.2.4 MTT法测MLC对靶细胞的杀伤及抗TNF-α对其的阻断 ［5］ 取MLC为效应细胞，ConA blast为靶细胞，调整效应细胞、靶细胞浓度加入96孔板中，使其效靶比分别为64∶1、32∶1、16∶1、8∶1、4∶1及2∶1。设立靶细胞及效应细胞对照孔，每个样品均为3个平行孔。（抗TNF-α对CTL的阻断实验中，在效应细胞中预先加入抗TNT-α多克隆抗体，使其终浓度为1∶20、1∶200、1∶2000及0;37℃温浴30min，再加入靶细胞）在各孔均加入5mg/ml的MTT10μl，37℃5%CO 2 培养箱孵育4h后离心，去上清。各孔加入DMSO100μl。室温下，震荡10min后，在酶联检测仪上570nm波长处测OD值。根据以下公式计算杀伤活性。CTL杀伤活性=（靶细胞对照孔OD值+效应细胞对照孔OD值-实验组OD值）/（靶细胞对照孔OD值+效应细胞对照孔OD值）×100%。
1.2.5 检测实验条件下两型外源性TNF对CTL的杀伤 用凋亡检测试剂盒，按说明书操作。荧光显微镜照相或流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 CTL实验模型的建立 采用单向混合淋巴细胞培养的方法获取MLC。用流式细胞术检测在同种异体MHC抗原刺激前后，淋巴细胞中CD3 + 、CD4 + 及CD8 + T细胞的比例，及CD8 + T/CD3 + T、CD4 + T/CD8 + T比值的变化，见表1。从表1可以看出CD8 + T淋巴细胞占MLC的一半以上，CD4 + T/CD8 + T细胞的比值，由刺激前的1.64倒置为0.70（P<0.05），提示CD8 + T细胞经过抗原刺激后，能大量增殖，是MLC中的优势细胞群。
表1 刺激前后淋巴细胞中CD3 + 、CD4 + 及CD8 + T细胞的比例 （略）
取提供刺激细胞的志愿者或无关第三者的ConA blast作为靶细胞，观测MLC对其的杀伤效应，见图1。图1显示，用单向混合淋巴细胞培养的方法获取的MLC，对具有特异抗原的同种异体靶细胞有特异杀伤活性，且其杀伤力与效靶比成正相关;而它的非特异杀伤活性则较低，保持在10%以下。提示起杀伤作用的主要是抗原特异性CTL细胞，从而证明了实验模型的成功建立。
图1 MLC对其靶细胞进行杀伤时效靶比与杀伤率的关系曲线图
2.2 两型内源性TNF-α在活化的CTL杀伤靶细胞时的表达及作用 我们检测了单向混合淋巴细胞培养后的MLC的mTNF-α的表达及分泌至上清的sTNF-α的含量，见图2。图2结果显示:在初次接触同种异体抗原及IL-2的刺激下，CTL活化增殖分化并产生一定量的sTNF-α和mTNF-α（两者P<0.05），当活化的CTL再次接触靶细胞上的特异性抗原时，两型TNF-α的生成明显增加（两者P<0.01）。提示TNF-α可能直接或间接参与CTL的杀伤效应。将MLC与抗TNF-α抗体预先作用30min，然后加入靶细胞，结果见图3。图3所示，抗TNF-α抗体并不能明显影响MLC对其靶细胞的特异性杀伤效率（P<0.01）。提示在本实验模型中，两型TNF-α并不直接参与杀伤。
2.3 外源性两型TNF-α对活化CTL毒性作用的检测 为了排除实验条件下的外源性TNF-α对活化的CTL产生毒性作用的可能性，故用凋亡试剂盒检测实验剂量的两型TNF-α作用24h的MLC的凋亡与坏死的情况，并进一步用FACS定量分析，结果见图4:外源性两型TNF-α在本实验条件下，诱导MLC发生的凋亡率、坏死率及死亡率都很低（与对照组相比P>0.05），即证实了在本实验模型中所用剂量的两型TNF-α均对活化的CTL无明显的毒性作用。
图2 MLC杀伤靶细胞时两型TNF-α的表达的直方图
图3 抗TNF-α抗体对MLC杀伤率的影响
图4 FACS检测外源性两型TNF-α对MLC毒性作用的直方图
3 讨论
本实验在国内外率先研究了两型TNF-α对CTL细胞毒功能的影响，即比较两型TNF-α对CTL细胞毒介质影响的异同。首先，我们建立了mTNF-α及CTL的实验模型。在外周血中，针对特异性抗原决定基的CTL前体细胞只占总淋巴细胞的1/1000以下，被抗原刺激增殖后所占的淋巴细胞的比例还很低 ［6］ 。而同种异体MHC抗原能刺激CTL大量增殖 ［7］ ，所以我们选取了MLC作为CTL的实验模型。根据实验模型杀伤活性及其特异性实验，证明了它的成功建立。国外曾有报道，在MLC中，CD8 + T的比例会随培养时间的延长而增加 ［8］ 。为此我们检测了培养前后淋巴细胞中T细胞各亚群的含量，结果发现CD8 + T的含量及CD8 +T/CD4 + T都有增长，说明了CD8 + T有了增殖分化，它在对 靶细胞的杀伤过程中可能起主要作用。由于有CD4 + T的存在，且其主要的杀伤途径与CD8 + T类似，所以本实验没有进一步研究CTL的类别及其在杀伤中所起的作用的比例。由于两型TNF-α都是CTL自身的表达产物，所以我们在分析外源性TNF-α对CTL的影响前检测了内源性TNF-α的表达与否及其在CTL细胞毒功能中所起的作用。国内外不同的实验室所采取的不同CTL模型，就此问题所报道的结果大相径庭 ［9］ 。而我们的实验证明，经过混合淋巴细胞培养所获取的MLC，其细胞上有一定比例的mTNF-α的表达，培养上清中有一定量的sTNF-α，但量较低;而它们经过靶细胞抗原的再次刺激后其表达分别增加2～4倍，与Asselin Paturel等报道的结果相近;他们在后期的实验中证明了TNF-α参与了CTL对靶细胞的杀伤 ［10］ 。而我们的抗体阻断实验的结果则刚好相反，即两型TNF-α不参与CTL对靶细胞的杀伤。抗TNF-α多克隆抗体是由本室自备，在近期的抗体阻断实验中已证实有较强的拮抗活性，从而排除了抗体活性不高所致的阻断无效的可能。实际上，TNF能否介导靶细胞的死亡以及死亡的方式，与以下几个因素有关:（1）靶细胞的种类:Scott等发现，TNF-α诱导靶细胞死亡的方式具有组织特异性;（2）受体表达的水平及种类:Masahiro等认为只有两型TNF-α皆表达的细胞才发生凋亡;（3）TNF-α的种类:Schutze等发现sTNF-α诱导细胞的死亡以坏死为主，而mTNF-α则以凋亡为主。所以本实验模型中两型TNF-α没有参与CTL对靶细胞的杀伤，可能该靶细胞由于其分化状态及TNF-α受体表达水平处于对其不敏感的状态，故不能被TNF-α直接杀伤。在体内机体发生免疫应答时，激活的T细胞FasL、TN-FR的表达上调，它们可通过与相应的配体作用，启动凋亡，发生所谓的激活诱导的细胞死亡（AICD），从而对机体的免疫应答强度进行反馈调节。为了检测实验条件下的两型TNF-α，在体外是否导致MLC发生AICD效应，我们用凋亡试剂盒检测了经两型TNF-α处理的MLC的死亡率。本实验结果发现:两型外源性TNF-α在实验条件下对MLC无明显的杀伤作用。相反，两型外源性TNF-α对MLC的生存还有一定的促进作用，与国外报道的TNF-α能促MLC增殖相一致。可能由于作用时间较短，本实验中TNF所表现的促进作用较小，所以在本实验所设定的TNF-α的剂量及作用时间下可对CTL的功能进行进一步的观测探讨。
参考文献
1 Krigler M，Perez C.A novel form of TNF/Cachectin is a cell surface cy-totoxic transmembrance proteins:remification for the complex physiology of TNF.Cell，1988，53:45.
2 Brockhaus M，Schoenfeld HJ.Identification of two types of tumor necro-sis factor receptors on human cell lines by monoclonal antibodies.Proc Natl Acad USA，1990，87:3127.
3 Kagi DF，Vignaux B.Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity.Science，1994，265:528.
4 Bejarano MT，de Waal Malefyt R.Interleukin10inhibits allogeneic pro-liferative and cytotoxic T cell responses generated in primary mixed lym-phocyte cultures.Int Immunol，1992，4（12）:1389-1397.
5 何今生.MTT还原法检测NK细胞活性的方法学研究.中国免疫学杂志，1996，12:356.
6 Anna Ratner，William R，Clark.Role of TNF-αin CD8+ cytotoxic T lymphocyte-mediated lysis.J Immunol，1993，150:4303.
7 Tsuchida T，Parker KC.Autoreactive CD8+ T-cell responses to human myelin protein-derived peptides.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（23）:10859-10863.
8 Ando K，Hiroishi K.Perforin，Fas/Fas ligand，and TNF-alpha path-ways as specific and bystander killing mechanisms of hepatitis C virus-specific human CTL.J Immunol，1997，158（11）:5283-5291.
9 Smyth MJ，Sedgwick JD.Delayed kinetics of tumor necrosis factor-me-diated bystander lysis by peptide-specific CD8
+ cytotoxic T lympho-cytes.Eur J Immunol，1998，28（12）:4162-4169.
10 Asselin Paturel.Failure of TGF Betal and IL-12to regulate human FasL and mTNF alloreactive cytotoxic T cells pathways.Tissue Anti-gen，1998，51:242.
（编辑建 光）
作者单位:510080广东广州中山大学第一附属医院消化内科
510080广东广州中山大学医学院免疫学教研室