HPV-16E6 E7 HLA-A2限制性CTL表位的预测

    【摘要】  目的  预测人乳头瘤病毒（HPV）16型E6 E7癌蛋白的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位。方法  采用超基序法与量化基序方案相结合的办法，对目的蛋白HPV-16E6 E7的HLA-A2限制性CTL表位进行预测。结果  E6、E7各发现3个HLA-A2限制性CTL表位。E6：KLPQLCTEL（18～26）（46.31）、CVYCKQQLL（37～45）（19.96）、FAFRDLCIV（52～60）（8.39）；E7：TLHEYMLDL（7～15）（293.86）、RLCVQSTHV（66～74）（21.08）、LLMGTLGIV（82～90）（7.99）。结论  超基序法与量化基序方案联合应用可以提高预测效率。

    【关键词】  HPV-16 E6E7；HLA-A2；T淋巴细胞表位；预测；超基序；量化基序

     Prediction of HLAA2restricted CTL epitope derived from human papilloma virus-16 E6 E7

    ZHANG Li,LV Fenglin.Department of Obstetrics and Gynecology,Kunming General Hospital,Chengdu Military District,Kunming 650032,China

    【Abstract】  Objective  To predict the HLAA2restricted CTL epitopes derived from human papilloma virus16E6 E7.Methods  HLAA2restricted CTL epitopes of HPV16E6 E7 were predicted by peptied supermotif prediction method combined with quantitativemotif.Results  Three HLAA2restricted CTL epitopes of HPV16 E6E7 were found,respectively.There were E6:KLPQLCTEL(18～26)(46.31)，CVYCKQQLL(37～45)(19.96)，FAFRDLCIV(52～60)(8.39)；E7:TLHEYMLDL(7～15)(293.86)，RLCVQSTHV(66～74)(21.08)，LLMGTLGIV(82～90)(7.99).Conclusion  The combination of supermotif with quantitativemotif can improve the predictive efficiency.

    【Key words】  HPV16E6 E7;HLAA2;CTL epitope;prediction;supermotif;quantitativemotif

    近年来肿瘤特异性免疫治疗的研究迅速发展，其基本原理是根据细胞毒性T淋巴细胞（CTL）可以特异性识别存在于肿瘤细胞表面的抗原多肽（这种识别受MHC-Ⅰ类分子限制），当肿瘤抗原多肽在抗原提呈细胞（APC）的作用下以MHC-肽分子复合物的形式被呈递于APC表面时被CTL所识别，同时CTL也被激活增生分化为具有杀瘤活性的CTL，从而特异杀伤肿瘤细胞。基于这一理论基础，肿瘤抗原的发现以及CTL表位鉴定成为特异性免疫治疗及多肽疫苗研制的重要前提。细胞免疫尤其是CD8+ CTL细胞亚群在抗胞内寄生菌、病毒、某些真菌感染及抗肿瘤免疫中起着十分重要的作用。国内外学者结合CTL的这些特点以及CTL表位的研究情况，以CTL表位为基础进行疫苗设计，希望能够诱导机体产生保护性CTL免疫应答从而预防和治疗疾病。

    多肽疫苗是针对T细胞和某些B细胞的免疫表位而设计的。T细胞识别抗原是靶细胞或抗原呈递细胞MHC-Ⅰ类或Ⅱ类分子呈递的由8～12个氨基酸组成的多肽。已知HPV-16E6 E7是HPV相关肿瘤特异性肿瘤排斥抗原，含多个线性B细胞表位、CD4+ T细胞表位和CD8+ CTL表位，与MHC分子亲和力高，抗原性强，是HPV疫苗设计公认的靶抗原［1］；而且在HPV肿瘤细胞中表达的主要是癌蛋白E6 E7，因此对HPV-16 E6 E7的CTL表位进行预测并制备其相应的多肽疫苗是十分有意义的。同时由于HPV-16 E6 E7 CTL表位可以被HLA-A2、HLA-A3分子递呈，而我国HLA-A2阳性人群高达53%［2］，故预测HPV-16E6 E7 HLA-A2限制性表位就更具有现实意义。本研究采用超基序法与量化基序方案相结合，拟预测由9个氨基酸残基组成的HLA-A2限制性CTL表位，为多肽疫苗的研制提供理论基础。

    1  材料与方法

    1.1  目的抗原  肿瘤抗原选用HPV-16 E6 E7蛋白，由E6：158个、E7：98个氨基酸残基组成，分子量为E6：1.8×104、E7：1.8×104和1.6×104两种形式。其氨基酸序列为：E6：MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HEIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVC DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INCQKPLCPD EKQRHLDKKQ RFHNIRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL；E7：MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP。

    1.2  CTL表位预测的超基序方案  对于某一HLA分子，其结合抗原肽的锚定氨基酸残基性质不同，这种特征结构称为HLA分子的等位基因特异性抗原肽一致性基序（allele-specific consensus motif），但不少属于同一HLA家族，甚至不同家族的HLA同种异型分子所接纳的抗原肽可有相同或相似的锚定氨基酸残基，这种特征称为结合抗原肽的超原序（supermotif）。现已根据HLA-Ⅰ类分子接纳抗原肽的肽基序，将HLA-Ⅰ类分子归纳为4个超基序家族，即A2、A3、B7和B44［3］。HLA-A2型所接纳的抗原肽具有相同或相似的锚定氨基酸残基，即肽链2位（P2）与羧基末端的氨基酸残基（P9）应是丙氨酸（A）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、缬氨酸（V）或苏氨酸（T）。

    1.3  CTL表位预测的量化基序法  量化基序法的原理是在抗原肽与HLA-A2分子的结合中，抗原肽的侧链效应（锚定，抑制或中性），主要依赖于相应的氨基酸残基在肽中所处的位置，而受相邻的氨基酸残基影响较小。在一定的范围内，可以假设一个多肽序列中每个氨基酸残基相互独立且影响整个肽与MHC-Ⅰ类分子的结合，而该抗原肽的结合能就是每个位置氨基酸残基结合能的综合。基于这种假设，1993年Parker［4］等用肽结合实验分析了154个九肽与HLA-A2分子和亲和力，并得到一个包含180个系数的结合矩阵（见表1），其中每一个系数反映了相应氨基酸残基在该位置时与HLA-A2分子的结合能。对于某测定多肽，各位置相应氨基酸残基结合系数相乘再乘标准系数0.151，即为该多肽与HLA-A2的结合力。当结合系数≥5时，可以确定为与HLA-A2分子结合稳定，反之认为结合不稳定。本研究采用HLA-A2分子的结合矩阵，对超基序法预测出的CTL表位进一步采用量化基序进行验证，以寻求结合最好的表位。表1  HLA-A2分子限制九肽结合系数

    2  结果

    2.1  超基序方案预测结果  根据超基序方案，预测出E6 5个、E7 15个候选表位九肽，分别是：E6：KLPQLCTEL（18～26）、QLCTELQTT（21～29）、QTTIHEIIL（27～35）、CVYCKQQLL（37～45）、FAFRDLCIV（52～60）；E7：DTPTLHEYM（4～13）、LTLHEYMLDL（7～15）、YMLDLQPET（11～19）、MIDLQPETT（12～20）、DLQPETTDL（14～22）、EIDGPAGQA（37～45）、TLRLCVQST（64～72）、RLCVQSTHV（66～74）、CVQSTHVDI（68～76）、STHVDIRTL（71～79）、DIRTLEDLL（75～83）、TLEDLLMGT（78～86）、DLLMGTLGI（81～89）、LLMGTLGIV（82～90）、GTLGIVCPI（85～93）。随后对预选出的HLA-A2限制型表位进行量化处理，寻找最好的结合。

    2.2  量化基序法预测结果  利用九肽矩阵对每一个超基序法预测出的CTL表位进行量化基序结合系数运算，结果E6有3个表位结合系数≥5，它们是：KLPQLCTEL（18～26）（46.31）、CVYCKQQLL（37～45）（19.96）、FAFRDLCIV（52～60）（8.39）；E7有3个表位结合系数≥5，它们是：LTLHEYMLDL（7～15）（293.86）、RLCVQSTHV（66～74）（21.08）、LLMGTLGIV（82～90）（7.99）。

    3  讨论

    CTL在机体抗细胞内感染和抗肿瘤免疫中发挥着极为重要的作用。靶抗原需先经抗原提呈途径以“抗原肽-MHC-Ⅰ类分子”的复合物形式呈现于APC或靶细胞表面才能被表达有特异性TCR的CTL所识别，相应的与MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽即为CTL表位。相关晶体结构学的进展加深了我们对MHC-Ⅰ类分子与抗原肽相互作用规律的认识。MHC-Ⅰ类分子由一条重链和β2微球蛋白组成，重链α1和α2结构域中的两个α螺旋和一个8片层的β折叠共同构成了一个两端封闭的肽结合槽（croove），其内顺次分布着由氨基酸侧链形成的6个口袋（pocket）A-F，其中在与抗原肽结合中起主要作用的是B和F两个口袋［5］。对于某型MHC-Ⅰ类分子，它所结合的抗原肽在特定位点上常出现某几个特定氨基酸残基，它们在结合中起着锚点作用。以往鉴定CTL表位的技术路线为：用酸洗脱法，将肿瘤细胞上与MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽洗脱下来，进一步观察这些抗原肽在体外是否能诱导CTL反应。甚至有人通过逐一合成重叠肽分别诱导CTL的办法来筛选CTL表位。这些方法显得繁琐、费时、耗资大。近年来随着对MHC-Ⅰ类分子与抗原肽结合规律及结合基序认识的深入，基于结合基序预测CTL表位的新方法已逐步被采用及推广。现在已产生了多种基序预测方法：（1）简单基序法。1991年Falk等［6］采用肽池测序法，发现大部分与HLA-A2分子有较高亲和力的九肽，其第二位氨基酸残基为L或M，第九位为V、I或L，基于此建立的表位预测法准确率为30%左右，但漏检率及假阳性率均较高；（2）延展基序法。Ruppert等［7］通过对大量与HLA-A2分子结合的多肽中的氨基酸残基出现频率的统计分析，证明多肽与HLA-A2分子的有效结合不仅与简单基序有关，还与二级锚点的存在和一些不利于结合的氨基酸残基缺失有关。基于此建立的延展基序法准确率达到70%；（3）超基序法。Rammensee［8］综合了一些常见的MHC分子所结合的肽，确定了大量肽基序。经深入比较研究后，发现不少属于同一HLA家族，甚至不同家族的HLA同种异型分子所结合的抗原肽具有相同或相似的锚定基序，即超基序。该方法的建立大大降低了漏检率。（4）量化基序法。1994年Parker［4］等提出假设：在一个抗原肽中，每个氨基酸相互独立地以一定结合能影响着该肽与MHC分子的亲和力。他们用多肽结合实验分析了154个九肽与HLA-A2分子的结合能，并得出一个包含180个系数的结合矩阵（20aa X 9positions），其中每一个系数反映了相应氨基酸残基在该位置时与HLA-A2分子的结合能。1997年，Gulukota等［9］认为简单基序和延展基序对于某肽与MHC分子的结合并不是充分和必要的，他们通过分析463个九肽与HLA-A2的结合能力，进一步证明了“系数矩阵”的合理性，并提出以该方法预测表位具高灵敏度及可很好排除假阴性的特点，故优于基序法，可作为基序法的补充。朱波［10］等对黑色素瘤特异性抗原TRAG-3 HLA-A2型分子限制性CTL表位进行超基序法与量化基序法联合预测并合成了该表位的多肽，通过细胞杀伤实验，证明产生了很高的CTL效应。

    本实验采用超基序法与量化基序法联合应用，对HPV-16 E6 E7 HLA-A2型分子限制CTL表位进行预测，利用量化基序法对每一个位点氨基酸残基的结合力进行量化分析这一优点，大大提高了预测效率。首先采用超基序法对所有可能成为HPV-16 E6 E7的HLA-A2限制型CTL表位进行初步筛选，发现符合的CTL表位。然后再采用量化基序法，应用HLA-A2分子限制型九肽结合矩阵对表位进行定量计算且排序，发现结合最好的九肽表位，拟进一步进行分子模拟与细胞杀伤实验验证，为多肽疫苗的研制提供更可靠的依据。

    【参考文献】

    1  Tindle RW,Croft S,Herd K,et al.A vaccine conjugate of “ISCAR” immuno carrier and peptide epitopes of the E7 cervical cancer associated protein of HPV16 elicits specific responses.Clini Exp Immunol,1995,1019(2):265-271.

    2  Roetzschke O,Falk K,Stevanovic S,et al.Peptide motifs of closely related HLA class I molecules encompass substantial differences.Eur J Immunol,1992,22(9):2453-2456.

    3  Sideny J,Grey HN,Kub RT,et al.Practical biochemical and evolutionary implications of discovery of HLA class I supermotifs.Immunol Today,1996,17(6):261-266.

    4  Parker KC,Bednarek MA,Coligan JE.Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides base on independent binding of individual peptide side-chains.J Immunol,1994,152(1):163-175.

    5  Latron F,Pazmany L,Morrison J,et al.A critical role for conserved residues in the cleft of HLA-A2 in the presentation of a nonapeptide to T cell.Science,1992,257(5072):964-967.

    6  Falk K,Roetzschke O,Stevanovic S,et al.Allete-specific emotifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules.Nature,1991,351(6324):290-296.

    7  Ruppert J,Sidney J,Celis E,et al.Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2.1 molecules.Cell,1993,74(9):929-937.

    8  Rammensee HG,Friede T,Stevanoviic S,et al.MHC ligands and peptide motofs:First listing.Immunogenetics,1995,41(4):178-228.

    9  Gulukota K,Sidney J,Sette A,et al.Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules.J Mol Biol,1997,267(5):1258-1267.

    10  Zhu Bo.Synthesis and identification of predicated CTL epitopes devived from the tumor antigen TRAG-3.Clinic Cancer Research,2003,5:35-40.

    *基金项目：本课题受重庆市攻关课题项目资助（批准号：01-6647）

    作者单位： 1 650032 云南昆明，成都军区昆明总医院妇产科

    2 400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室

　　 (编辑：萧  凝)