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【摘要】 目的 摸索出皮下注射（sc）利血平造成小鼠脑内单胺类神经递质含量变化，且对小鼠行为、形态变化影响不大的sc利血平造模法。 方法 分别sc利血平0.7、0.4、0.15mg/（kg·d），在4、6、9天断头取脑，用RP-HPLC荧光检测器检测脑内4种单胺类神经递质含量。 结果 0.7剂量组小鼠行为学几近无生命力，4种神经递质含量统计学上与空白组比较差异有显著性;0.4组6天有1值统计学无意义，9天组行为学与0.7组无异，而4天时行为学优于0.7组，RP-HPLC检测在统计学上有意义;0.15组行为、形态好，但RP-HPLC检测结果大多在统计学上无意义。 结论 根据本实验，建议用利血平注射液造模偏头痛小鼠模型时，采用0.4mg/kg造模4天。
关键词 偏头痛 动物模型 RP-HLPC荧光检测法
偏头痛是常见病、多发病之一，其发病机制至今尚未清楚。5-HT、儿茶酚胺（去甲肾上腺素及多巴胺）等神经递质早已被提出与偏头痛发作有关。偏头痛前驱期，大量释放的5-HT直接作用于脑膜血管上的5-HT受体，过度收缩脑膜血管;在头痛发作的前期，5-HT水平急剧下降，而尿中5-HT代谢产物增加，使脑膜血管扩张;给予5-HT释放剂芬氟拉明或利血平排空5-HT均能诱发偏头痛，这些事实都支持5-HT的功能紊乱与偏头痛的相关性。同时研究表明偏头痛患者中绝大多数症状可通过刺激多巴胺能系统而诱发，而多巴胺受体，尤其是多巴胺D2受体（DRD2）拮抗剂治疗偏头痛有效，多巴胺-β-羟化酶（D-β-OH）被认为是反应交感活性高低的指标，匡培根［1］ 及Callai等 ［2］ 研究发现，血清D-β-OH不论头痛期还是非头痛期均较对照低，但头痛发作期较间歇期增高。去甲肾上腺素（NA）在偏头痛发作前3h内升高，头痛时下降，血浆水平改变与5-HT相平行。
临床研究也发现，偏头痛患者外周血5-HT发病先兆期升高，发病高峰时降低，表明体内5-HT有一个由释放到消除的过程，这种5-HT含量的变化是偏头痛发作的主要直接原因，发现单胺类递质耗竭剂利血平能够诱发偏头痛。
本实验通过参考偏头痛的病因病机及文献资料的造模方法 ［3～5］ ，于实验中发现:皮下注射（sc）利血平剂量过大，小鼠容易死亡，行为变化太大，几近无生机;过小，则脑内神经递质含量变化在统计学上差异无显著性。此实验对利血平诱发偏头痛的动物模型进行了初步探讨，为摸索出sc利血平造成小鼠脑内单胺类神经递质含量变化，且对小鼠行为、形态变化影响不大的sc利血平造模剂量。
1 材料与方法
1.1 材料仪器 高效液相色谱仪230型（美国），荧光检测器363型（美国），自动进样仪410型（美国）;色谱柱YWC-Pack ODS-A S-5μm12nm C18柱（250mm×4.6mm）;隔膜真空泵GM-0.33（天津市腾达过滤器件厂）;数控超声波清洗器KQ3200DB（江苏昆山市超声波仪器有限公司）;恒温磁力搅拌器JBZ-14型（上海志威电器有限公司）;pH酸度计PH201型（葡萄牙）;旋涡混合器XW-80A（上海精科实业有限公司）;超速冷冻离心机TGL-16G（上海安亭科学仪器厂）;电动玻璃匀浆机DY89-Ⅰ（宁波新芝科器研究所）。
1.2 试剂和药物 DA、NE、5-HT、5-HIAA均为Sigma产品;EDTA-2Na（上海国药集团化学试剂有限公司，20040201）;NaAC（无锡犀牛化工有限公司，20040302）;冰乙酸（杭州高晶精细化工有限公司，20040516）;甲醇为优级纯（德国Merk）;水为用娃哈哈纯净水重蒸馏3次;利血平1mg/ml（上海复旦复华药业有限公司，030108）。
1.3 实验方法
1.3.1 造模及处理方法 KM雄性小鼠120只，18～22g，随机分为12组，每组10只:0.7mg/kg4天处死、6天处死、9天处死组;0.4mg/kg4天处死、6天处死、9天处死组;0.15mg/kg4天处死、6天处死、9天处死组;空白对照4天处死、6天处死、9天处死组;处死组连续按剂量分别sc利血平4天、6天、9天，后2h断头取脑，操作时须在冰台上进行，1min内取出全脑，用冰冷的生理盐水冲洗，除去血液，滤纸拭干，立即投入液氮中，固化后称重，每个脑组织大约加冰冷的0.4mol/ml高氯酸液700μl，在冰浴中用电动的玻璃匀浆器匀浆2min/个脑组织（固定转速和匀浆次数），将脑组织匀浆液转入Ependet离心管中涡流2min，置冷冻离心机（4℃）内以12000r/min离心20min。将离心后的上清液转入Ependet离心管中，再以12000r/min二次离心15min，取上清液用0.4mol/L高氯酸溶液定容至1ml，涡流混匀，得样品溶液。
1.3.2 统计学方法 用SPSS统计软件对实验数据进行处理。计量资料用（ˉx±s）表示，模型对照组和空白对照组间进行两两比较。
1.3.3 样品的含量测定 流动相0.1mol/L的NaAC（内含0.1mmol/LEDTA-2Na），用HAC调pH值至5.09，取此缓冲液与甲醇按9∶1混合，用0.33μm的微孔滤膜过滤，超声脱气，流速为1.0ml/min，进样量30μl/次;发射波长330nm，激发波长290nm;灵敏度2;柱温31℃。在此色谱条件下4种神经递质的HPLC图见图1及图2。取120只小鼠的大脑，照拟定的方法操作，取样品溶液30μl注入液相色谱仪，根据测得的峰面积值按回归方程计算4种神经递质的含量，结果见表1。
2 结果
2.1 线性关系考察 分别精密称取L-NE5.0mg、L-DA3.8mg、5-HT3.6mg、5-HIAA3.6mg，用0.1mol/L HCl溶解定容至10ml。从中取1ml混合后，用0.1mol/L HCl稀释1000倍摇匀，精密吸取2、4、8、16、32μl进样。以吸收峰峰面积值对含量做线性回归，求得4种递质的回归方程及线性范围分别为，L-NE:Y=3.5458×10 7 X-1.0372×10 4 ，r=0.9994，0.001～0.016μg;L-DA:Y=4.8385×10 7 X-1.6525 ×10 4 ，r=0.9996，0.00076～0.01216μg;5-HT:Y=2.554×10 8 X-4.0276×10 4 ，r=0.9995，0.00072～0.01152μg;5-HI-AA:Y=3.9053×10 8 X-3.8510×10 4 ，r=0.9997，0.00072～0.01152μg。
表1 利血平造模小鼠脑内4种单胺类神经递质的含量 （略）
注:与空白对照组比较， * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.0001; ◇ P>0.05
图1 标准品的4种神经递质图谱（略）
图2 样品4种神经递质HPLC图谱（略）
2.2 精密度实验 取一定量的混合标准溶液，按拟定方法连续进样6次，测定峰面积。结果L-NE、L-DA、5-HT和5-HIAA变异系数分别为3.58%、3.67%、3.51%和1.93%。
2.3 加样回收率实验 取知含量的小鼠脑组织匀浆液200μl，加混合标准液100μl及0.1mol/ml HCl200μl，混匀，从中分别取20、30、40μl混合液各进2针，共6针，照原定的方法进行含量测定，平均回收率L-NE、DA、5-HT、5-HIAA分别为94.72%、95.16%、101.9%、108.73%。
2.4 重复性实验 取一定量样品溶液，按拟定方法重复进样测定6次，L-NE、L-DA、5-HT、5-HIAA5种神经递质的RSD分别为3.610%、3.698%、4.432%、4.675%，表明重复性良好。
2.5 稳定性实验 取一定量的样品溶液，按拟定的方法在0、1、2、4、8、12h各进1针，结果证明在4h内稳定。L-NE、L-DA、5-HT和5-HIAA变异系数分别为3.176%、1.767%、4.232%、4.117%。
3 讨论
3.1 一般观察 0.7剂量组小鼠皮下注射利血平1h后有部分眼眯成线状，不喜动;20h后出现眼睑下垂，眼睛眯成线状，精神不振，动物体温明显下降，四肢震颤，类似寒战，倦缩不动，毛发无光，可见小鼠前肢腕关节弯曲，贴近躯干，步态失常，脊背拱起，两耳竖起，头缩向躯干，前肢紧贴口鼻，肛门口有粪便堆积，部分腹下部湿漉，体重逐日下降;到5天时生命力弱;8～9天时小鼠消瘦见骨，浑身冰凉，几近无生命现象，有几只死亡。0.4组20h后有部分眼睛眯，身体倦缩，活动力强于0.7组，体重逐日下降;7天时眼眯，倦缩不动，活动力不强，浑身凉;8～9天与0.7组行为学无异。0.15组20h后行为与空白组无异;到6天时前体重逐日增加;7天时起部分倦缩，活动力比空白组差，但眼睛开，浑身体温无变化，体重无变化。
3.2 RP-HPLC荧光检测法 结果表明4、6、9天0.7剂量组P值都提示差异有显著性;0.4组除6天时5-HT结果差异无显著性，其余结果差异均有显著性;0.15组4、9天5-HIAA及4、6、9天5-HT结果差异无显著性，说明用0.15剂量组造模不成功。
综上所述，0.7组HPLC检测有意义，但行为学观察小鼠几近无生命力，恐造模后再用药效果不明显;0.15组行为、形态好，但HPLC检测结果大多在统计学上无意义;0.4组6天组有1值统计学无意义，9天组行为学与0.7组无异，而4天时行为学好于0.7组，HPLC检测在统计学上有意义。所以根据本实验，建议用利血平注射液造模偏头痛小鼠模型时，采用0.4mg/kg造模4天。
参考文献
1 匡培根.偏头痛的脑血管变化与血浆多巴胺-β-羟化酶.中华神经精神杂志，1983，3:154.
2 GallaiV，GaitiA，Sarchiellip，et al.Evidence for an altereal dopamine-hydroxylase activity in migraine and tension-type headache.Acta Neu-rol Scand，1992，86:403.
3 王巍，赵德忠，孙晓芳，等.首茸方对利血平小鼠脑内多巴胺及其代谢产物的影响.中国中药杂志，2002，27（5）:368-3704.
4 洪治平，贾冬，杜佳林，等.头痛平颗粒治疗偏头痛临床与实验研究.中国中医药信息杂志，2002，9（2）:17-19.
5 杜力军，孙虹，李敏，等.精制吴茱萸胶囊对偏头痛小鼠的作用.中药药理与临床，1999，15（3）:3-5.
（编辑明 石）
作者单位:310053杭州浙江中医学院