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【摘要】 目的 研究金银花超微饮片的HPLC指纹图谱，考察其有效成分及含量，为金银花的质控提供可靠方法。 方法 色谱柱为大连依利特公司Hypersil BDS C18（4.6mm×200mm，5μm）柱。流动相为甲醇-0.05%磷酸水溶液（9.8∶90.2），柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为246nm。 结果 建立了金银花超微饮片的HPLC指纹图谱，标定了12个共有峰。 结论 利用HPLC指纹图谱可以较全面地控制金银花超微饮片的内在质量。
关键词 金银花超微饮片 HPLC指纹图谱 高效液相色谱法
Studies on HPLC fingerprint of ultramicro Flos Lonicerae
Cai Guangxian，Li Shunxiang，Jiang Wei
Hunan Academy of TCM，Changsha410006.
【Abstract】 Objective To determine the HPLC fingerprint of the ultramicro Flos Lonicerae and to test its po-tent constituents and content.Methods Chromatographic column:Hypersil BDS C18（4.6mm×200mm，5μm）.Mo-bile phase:MeOH-0.05%H 3 PO 4 （9.8∶90.2）.Column temperature:25℃.Flow rate:1.0ml/min.Wavelength:246nm.Results The fingerprint of ultramicro Flos Lonicerae was established and12common peaks were in the fin-gerprint.Conclusion The methods and data can be used to control the quality of the ultramicro Flos Lonicerae.
Key words ultramicro Flos Lonicerae fingerprint HPLC
金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicerae japonica Thunb）、红腺忍冬（L.hypoglauca Mip）、山银花（L.confusa DC）或毛花柱忍冬（L.dasystyla Rehd）的干燥花蕾或带初开的花 ［1］ ，湖南产灰毡毛忍冬（L.macranthoides Hand.-Mazz） ［2］ 将列入新版药典。本品为传统中药，具有清热解毒、凉风散热的作用。本实验对13批不同地区的商品金银花药材制成的超微饮片进行测定，并进行方法学考察，初步建立了指纹图谱，标定了12个共有指纹峰，其中绿原酸为对照品。
1 仪器与试剂
岛津（Shimadzu）LC-10A高效液相色谱仪（配有LC-10Avp输液泵，SPD-10Avp紫外检测器，柱温箱）。绿原酸对照品（chlorogenic acid，批号0753-200111，供含量测定用中国药品生物制品检定所提供），甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂为分析纯。13批商品金银花药材购自四川、杭州、甘肃、北京、湖南等地，经湖南中医药研究院中药研究所生药室谢昭明研究员鉴定分别为忍冬（Lonicerae japonica Thunb）、灰毡毛忍冬（L.macranthoides Hand.-Mazz），分别加工成超微饮片。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备 精密称取超微饮片粉末0.2g（共13种），置50ml量瓶中，加50%甲醇约50ml，超声处理30min，放冷，用50%的甲醇精密加至刻度，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品4mg于50ml的棕色容量瓶中，加50%的甲醇定容至刻度，摇匀，即得（10℃以下保存）。
2.3 色谱条件 色谱柱为大连依利特公司Hypersil BDS C18柱（4.6mm×200mm，5μm）。色谱条件:流动相为甲醇-0.05%磷酸水溶液（9.8∶90.2），柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为246nm。该条件下金银花超微饮片获得好的分离，见图1。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度实验 取同一份金银花（忍冬）超微饮片的供试品连续进样5次，比较共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致。符合指纹图谱的检测要求。见表1、表2。
表1 精密度实验结果（相对保留时间）（略）
表2 精密度实验结果（相对峰面积）（略）
2.4.2 稳定性试验 取同一份金银花超微饮片的供试品溶液，分别在制备后1、4、8、16、24、48h进样，比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD<2%，表明样品在48h内稳定，符合指纹图谱的检测要求。
2.4.3 重现性试验 取同一批金银花（忍冬）超微饮片样品5份，按供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液，比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致。符合指纹图谱的检测要求。
2.5 指纹图谱的建立
2.5.1 共有指纹峰的标定 采用相对保留时间标定共有指纹峰:以图谱中绿原酸为参照物（S），将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间，见表3。
表3 10批金银花（忍冬）超微饮片的相对保留时间（略）
2.5.2 共有指纹峰的相对峰面积 以图谱中绿原酸为参照物（S），将各共有指纹峰峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较，其比值为各共有指纹峰的相对峰面积。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》的规定 ［3］ ，单峰峰面积占总峰面积<10%时，峰面积比值不作要求，仅需标定相对保留时间，但我们将其全部标出。见表4。
2.6 金银花超微饮片中绿原酸的含量测定
2.6.1 绿原酸线性关系考察与含量测定 照《中国药典》 ［1］ 金银花项下的含量测定条件，精密量取配置好的绿原酸对照品不同浓度溶液，进样测定，以绿原酸进样量为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，绘标准曲线，得回归方程:Y=1868110.526X+19735（r=0.9995）。绿原酸在0.19～0.95μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算，即得。
2.6.2 13批不同来源金银花的超微饮片的绿原酸含量比较 见表5。结果显示，金银花产地、品种不同，其超微饮片的绿原酸含量有较大差别。湖南产灰毡毛忍冬L.macranthoides Hand.-Mazz的绿原酸含量高于其他产地与品种。
2.7 相似度计算 采用中南大学“计算机辅助相似性评价系统”进行相似度计算。有关参数设置如下，预处理:数据压缩5000×11，压缩层数2;数据平滑:使用移动窗口多项式最小二乘拟合平滑;数据平移:三标准峰平移。谱峰处理:谱峰识别所有指纹图谱同一阈值0.02;自动谱峰匹配。相似度计算结果见图2。
2.8 不同植物来源的金银花（忍冬Lonicerae japonica Thunb与灰毡毛忍冬L.macranthoides Hand.-Mazz.）的指纹比较 见图3。
表4 10批金银花（忍冬）超微饮片共有指纹峰的相对峰面积（略）
表5 13批不同来源金银花的超微饮片的绿原酸含量结果（略）
3 讨论
超微饮片是我院研制的一种微米级新型中药饮片，因其原药材的形状、显微特征已不存在，采用指纹图谱技术来控制其质量具有较强的专属性。
本试验所用的对照品为绿原酸，参照《中国药典》中金银花下的含量测定方法 ［1］ 制备供试品溶液，参照文献 ［4，5］ ，试验出选择甲醇-0.05%磷酸水溶液（9.8∶90.2）为流动相的分离效果比较好，保留时间也适合。在试验中我们比较了220、246、327nm等不同的波长金银花药材峰的个数，发现金银花药材在较高的波长上峰的个数减少，检测波长定为246nm较宜。
对13批不同地区的商品金银花制成的超微饮片进行了绿原酸的含量测定，结果表明金银花因产地的不同，其有效成分的含量也有较大的差异。以其抗菌成分绿原酸作为判断指标，则湖南邵阳隆回小沙江产灰毡毛忍冬的质量最佳。在含量测定中，湖南邵阳隆回小沙江产灰毡毛忍冬的绿原酸的含量均高于其他产地的金银花。另外，购自深圳二天堂和深圳万泽的金银花经鉴定其品种也是灰毡毛忍冬，其绿原酸的含量也超出其他批次的绿原酸的含量，可以推断灰毡毛忍冬的质量优于忍冬的质量。
不同植物来源的金银花超微饮片HPLC指纹图谱差别较大。通过对灰毡毛忍冬与忍冬的指纹图谱进行比较可知它们在峰的个数及峰的相对强度方面均有区别。不同的超声提取时间对药材的绿原酸的提出率也有一定的影响。相似度计算结果表明，四组相似度的参数均在0.9以上，说明建立的指纹图谱相似度较好。
（本文图片见封三）（略）
参考文献
1 国家药典委员会.中国药典2000年版.一部.北京:化学工业出版社，2000，177.
2 湖南省卫生厅.湖南省药材标准.长沙:湖南科技出版社，1993，191-192.
3 国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）.中草药，2000，2（10）:671-575.
4 冯文宇，彭峰，何兵，等.金银花及其提取物指纹图谱研究.泸州医学院学报，2003，26（4）:283-286.
5 刘艳娥，吴玫涵，吴玉田，等.金银花药材高效液相指纹图谱研究.解放军药学学报，2003，19（3）:161-164.
（编辑新 竹）
* 基金项目:国家“十五”科技攻关项目“中药饮片及其超微饮片的质量标准规范化研究”（2001BA701A43），湖南省卫生厅中医药科研基金课题“骨碎补等湖南地道药材饮片的现代质量控制体系研究”（24303）
作者单位:410006长沙湖南省中医药研究院
410007长沙湖南中医学院