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【摘要】 肾脏细胞增殖与凋亡异常在肾脏疾病中具有重要意义，其调控最终发生在细胞周期水平上，细胞周期抑制蛋白P27属于细胞周期负向调控蛋白，与多种肾小球疾病中细胞增殖和凋亡异常有关，可能影响肾脏疾病进展，对此深入研究可为肾脏疾病的防治提供新的启示。
【关键词】 细胞周期； 细胞周期调控蛋白；肾小球疾病；P27
【Abstract】 Evidence is accumulating that those directly responsible for the rate of progression of glomerular disease are specific positive（cyclins and cyclin-dependent kinase）and negative （cyclin-kinase inhibitors） cell cycle regulatory proteins.P27 diffects glomerular cell proliferation and apoptosis as a kind of negative cell cycle regulatory proteins and may highly relate to the progress of renal disease.Ultimately the goal is to find ever more appropriate therapeutic strategies to arrest or prevent progressive renal disease.
【Key words】 cell cycle; cell cycle regulatory proteins;glomerular disease;P27
肾小球硬化是多种原因引起肾小球损伤后出现的共同转归，是肾功能衰竭的主要病理基础。而导致肾小球硬化最主要的原因就是系膜细胞增生和细胞外基质增多。其中细胞外基质的增多与系膜细胞增生又密切相关［1］。因此，探讨肾小球系膜细胞增生的内部机制及如何对其进行调控，已成为肾脏病领域的一个研究热点。
近年研究表明，细胞增生的调节最终都发生在细胞周期水平上，而细胞周期又受细胞周期调控蛋白的调控，细胞周期调控蛋白按其功能分为细胞周期正控蛋白和负控（抑制）蛋白。正控蛋白促进细胞周期进程，负控蛋白抑制细胞增生［2,3］。
1 细胞周期的概念
细胞增殖周期通常简称细胞周期，是指细胞从上一次细胞分裂结束到本次分裂终了的过程或间隔时间。根据细胞周期不同时相的特点，可将细胞周期分为4个连续阶段，即G1期 （gap phases 1），S期 （synthesis phase）,G2期（gap phases 2）及M期（mitotic phase）。细胞周期具有单向性和阶段性，细胞可因某种原因在某时相停滞下来，待生长条件好转后，细胞可重新活跃起来过渡到下一时相［4,5］。
1.1 G1期 是指从上一次有丝分裂完成到本次DNA复制之前的过程，持续时间一般为6～12h。G1期细胞的主要任务是积累能量和原料，为DNA的复制做准备，故又称DNA合成前期。
1.2 S期 即DNA合成期，持续时间一般为6～8h。S期末DNA含量增加1倍，细胞由二倍体变为四倍体。S期DNA的复制极其准确，每一段DNA只复制一次，从而可保证分裂后子细胞的遗传物质平均分配。
1.3 G2期 是指从DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间，持续时间一般为3～4h，只有完成了所有DNA复制后，细胞才进入G2期。故G2期又称DNA合成后期或有丝分裂前期。
1.4 M期 即有丝分裂期，一般持续时间为1h。在M期，细胞一分为二，一次细胞周期即告结束。本质上看，有丝分裂就是把细胞内已经倍增的大分子平均分配到2个子细胞中去。
此外，G0期 （静止期）不包括在细胞周期内，细胞在适宜刺激下能被触发，从G0期进入G1期。G1期在一定条件下也可退入G0期。此外，在细胞周期中至少有两个检查点，分别在G1/S和G2/M期。细胞周期的进程可停滞或终止于该处［6］。
2 细胞周期调控蛋白
2.1 细胞周期正控蛋白
2.1.1 周期素家族 （cyclin） 是一组结构类似能结合并调节周期素依赖蛋白激酶（CDK）的蛋白质，统称为cyclin家族。目前知道的有8种成员，即cyclinA，cyclinB，C，D…H。每一种cyclin有若干亚型，如D型包括D1，D2，和D3。周期蛋白在细胞周期的不同时相程序性合成与释放。它们作为调节亚基，需与特定的CDK结合，才能形成具有活性的全酶而促进细胞周期的进程。
2.1.2 周期依赖蛋白激酶家族（cyclin dependent kinase,CDK） 目前发现7种成员,有不同程度的同源性，故称CDK家族，各成员命名为CDK1，2，3…7。CDK含有催化亚基，但需要cyclin提供调节亚基才有活性，所以通常以cyclin- CDK复合物形式出现［6］。其中CDK2活性于G1晚期开始升高，在S期和M期达高峰，CDK2对G1/S转换是必须的。CDK的上游尚有CDK活化激酶，CDK也能与CDK的抑制物（负控蛋白）结合，而抑制细胞周期。
2.2 细胞周期负控蛋白（CDI） 又称周期素依赖激酶抑制物（CDI）。这些负控蛋白可与cyclin相互作用结合CDK而抑制全酶活性，从而抑制细胞增生。根据结构和所抑制的cyclin-CDK复合物的不同，可分为INK4（Inhibitor of CDK4）家族和CIP/KIP家族。INK4家族包括P15，P16，P18，P19等，可特异抑制cyclin-CDK4/6的磷酸化激酶活化而抑制细胞增生。CIP/KIP家族包括P21，P27，P57等，可抑制已知的大多数cyclin-CDK复合物的激酶活性，对G1期的早期与晚期、S期等各期都有重要作用，且分布与功能在不同的细胞各异，是目前的主要研究对象。其中P27作为一种重要的细胞周期负控蛋白，在肾小球疾病中的表达受到广泛的重视［7］。
2.3 关于P27 1994年发现并克隆出P27基因。P27最初从用TGF-β或细胞接触生长抑制的水貂肺细胞中分离出来的，被认为是一种热稳定蛋白。P27与cyclin-CDK结合成复合物，对后者有无抑制作用主要取决于P27的量，即所谓以化学剂量方式起作用。G0期细胞P27水平较高，从G0期到S期逐渐降低，在经过一个临界值后失去对cyclin D CDK4或cyclin D CDK6的抑制作用［8］。P27 在G1期维持较高水平，主要由于下述情况引起的周期阻滞：TGF-β处理、接触抑制、血清去除、Lovastatin处理、CAMP处理等［8］。IL-2可诱导外周血T细胞P27水平降低。单独用CSF-1（集落刺激因子-1）刺激巨噬细胞可使P27水平下降，改用“CSF-1+CAMP”刺激，则P27不下降，P27主要受细胞外刺激诱导表达。P27与P21有协同作用。P27的作用特点：（1）非特异性，P27可抑制所有CDK的活性。（2）化学剂量依赖性。
3 P27与肾小球疾病
作为一种重要的细胞周期负控蛋白，在正常静止状态下，P27在三种肾小球固有细胞都有相当强的结构型表达，它在肾小球疾病的细胞周期调控中起重要作用［2］。
3.1 对肾小球系膜细胞的影响 肾小球系膜细胞（MC）的增生及相应的系膜扩张是肾脏疾病的常见病理现象。以前的研究多局限于细胞外刺激因子（如细胞因子等）对细胞增生的影响，而对细胞外刺激因子怎样通过细胞内信号传导影响细胞增生的机制研究较少。现已明确，细胞增生受细胞周期调控蛋白控制。很多研究表明，P27可抑制MC增殖［3］。
近来研究发现，体外培养的MC予促分裂原如血小板源生长因子（PDGF）、内皮素-1或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 刺激后早期细胞周期素D和CDK4增加，随后CDK2与细胞周期素E，继而细胞周期素A数量及生物活性增加，而P27明显降低；予体外培养的MC转染针对P27的反义寡核苷酸可增强对PDGF、bFGF等的增殖反应；Terada等也证实舒降之 （lovastatin）通过提高P27蛋白水平可抑制系膜细胞增殖，使细胞周期停止于G1期，也可抑制细胞外基质如IV型胶原，层粘连蛋白和纤维连接蛋白的合成与积聚，并明显改善肾功能［9］。大鼠抗Thy1肾炎模型中P27与MC的增生程度呈负相关，早期P27明显下降，至MC增生最甚的第5天几乎不能测及，随后在MC停止增殖的恢复期P27水平回复到基础值，表明P27的下降可使细胞周期从G1期进展到S期，从而产生细胞增殖［10］；另外，有发现尽管Thy1肾炎大鼠及正常大鼠间肾小球P27水平差异有显著性，但两者P27mRNA水平差异无显著性，这同细胞上获得的结果相似，提示体内肾小球细胞可能是在转录后水平调节P27的表达，从而使Thy1肾炎肾小球P27水平降低［11,12］。在P27野生型（P27+/+）与P27基因敲除 （P27 -/-）小鼠试验中发现，正常生理状况下缺乏P27对肾脏DNA合成无影响，但在增生性肾小球肾炎模型中，P27-/-小鼠肾小球DNA合成及细胞增殖早，且在各时间点其程度皆明显甚于P27+/+小鼠；将前者作全身照射，并予正常P27+/+小鼠的骨髓移植后再行肾炎模型，证明上述结果与免疫反应的差异无关，肾小球内P27的水平调控着对损害的增生阈值及程度。在抗肾小球基膜抗体诱发的新月体肾炎模型中，与P27+/+相比，P27-/-小鼠的肾脏反应（包括细胞增生、新月体形成和基质蛋白合成积聚等）发生更早，程度更为剧烈，损害也更为严重［2］。在实验性肾小球肾炎模型中，P27-/-小鼠肾小球细胞凋亡较P27+/+的小鼠为著，而予P27-/-的小鼠再转染P27又可避免凋亡，提示P27有防止肾小球细胞凋亡的作用［3］。
3.2 P27对足细胞增殖与分化的影响 足细胞（肾小球脏层上皮细胞）是独特而高度分化的细胞，其对损害的反应不同于MC或内皮细胞，成熟足细胞通常已丧失增殖能力；在胚胎发育过程中肾小球发生的早期阶段未成熟足细胞具有增殖能力，但S状生肾囊泡形成后即退出增殖周期而成为终末分化的静止细胞，且维持此终末分化静止状态是成熟足细胞保持正常功能结构，履行生理功能特别是肾小球滤过屏障所必需［13］。动物实验提示在生肾过程中具有增殖能力的足细胞转型为静止细胞有赖于P27的表达上调，而维持成熟足细胞静止和终化状态可能与P27持续表达有关［2,3］。近年研究发现失去增殖能力的足细胞可能是许多类型肾小球硬化发生的基础。Wolf等［14］认为虽然随着年龄的增长，足细胞逐渐老化，但由于肾脏足细胞缺乏增生能力，导致足细胞不能相应的分裂增生，从而使足细胞功能受损，不能很好的覆盖肾小球基底膜，继而肾小球基底膜功能受到损害，导致肾脏硬化，因而推测P27可能是老年人肾脏功能逐渐丧失的重要因素。在实验性膜性肾病动物模型（被动性Heymann肾炎）中，予足细胞FxLA抗原的抗体可造成对足细胞补体依赖性损害，免疫染色显示足细胞内细胞周期素A和CDK2并无降低，甚有增高，但P27显著增高。免疫沉淀反应示P27与细胞周期素A- CDK2复合物的结合增加从而抑制DNA合成。由于足细胞缺乏修复损伤或丢失细胞的能力使肾小球基膜裸露致肾小球壁层上皮细胞侵占基膜以及肾小球毛细血管粘连是足细胞损害后阶段性肾小球硬化进展的重要因素［3,13］。正常成人肾小球足细胞有相当高的P27结构性表达，但缺乏P21；人类大多数累及足细胞的肾脏疾病如微小病变，膜性肾病等皆缺乏足细胞增生，也未证实有相关的细胞周期素与CDK上调及（或） CDI明显降低。但在特发性塌陷性肾病和人类免疫缺陷病毒相关肾病以及细胞性局灶节段性肾小球硬化的足细胞可检及细胞周期素A表达增加及P27明显降低甚或不能检及，伴P21的重新表达，并出现足细胞增生，常有肾功能急剧减退，提示P27等CDI对足细胞病变的结局有决定性影响［2,15］；最近研究显示这些增生的肾小球脏层上皮细胞失去正常成熟足细胞的多种标记（如WT1,podocalyxin、synaptopodin、GLEPP-1等）,出现表型调节异常和不再分化,可能是重要的病理基础［13］。
4 展望
总之，细胞周期抑制蛋白P27与肾小球细胞增殖有关，深入研究P27在肾小球疾病中的作用，有助于增加对肾脏疾病发病机制的认识。P27表达的调控可能影响肾脏疾病的进展，为肾脏疾病的防治提供新的途径。
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（编辑：田 雨）
作者单位： 121000 辽宁锦州，锦州医学院附属第一医院肾内科