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【摘要】 目的 检测MYCT-1(myc target)基因在胃黏膜GES-1细胞系中的表达,探讨GES-1细胞作为RNA干涉细胞模型的价值。方法 用TRIZOL法提取GES-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增MYCT-1 cDNA,DNA测序验证。结果 在GES-1细胞中检测到504bp MYCT-1 cDNA片段,测序证实与GenBank报道序列完全一致。结论 GES-1细胞中存在MYCT-1表达,可作为RNA干涉细胞模型。
【关键词】 MYCT-1;GES-1细胞系;RT-PCR
MYCT-1(myc target 1)是本室克隆的新候选抑癌基因,GenBank登录号NM_025107[1],曾命名MTLC(myc target from laryngeal cancer cells)。前期研究表明MYCT-1广泛表达于多种正常组织,且在胃癌、喉癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中表达下调[2~5]。为进一步研究MYCT-1基因的生物学功能及在肿瘤发生、发展中的作用,准备用RNA干扰(RNA interence, RNAi)技术沉默正常细胞中MYCT-1的表达,以了解MYCT-1低表达对正常细胞生长特性、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。本文用RT-PCR法和DNA测序检测胃黏膜GES-1细胞中MYCT-1的表达,探讨GES-1细胞作为RNA干涉模型的价值。
1 材料与方法
1.1 材料 GES-1细胞(肿瘤研究所);TRIZOL试剂、1640培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司);反转录酶、Taq酶(Promega公司);MYCT-1引物(大连宝生物公司),序列为:正向引物:5'-ATGGATCCCTGCACTGGCTGATGAGTGTGTA-3';反向引物:5'-GTAAGCTTGAACAGTGCCTTCACCCTCGA GGT-3';其他试剂均为国产分析纯。
1.2 细胞培养 将1.5×105 GES-1细胞接种至35mm培养皿中,加入含10%胎牛血清1640培养基,在5%CO2、37℃条件下培养,铺满后以0.25%胰酶消化传代,4h后细胞贴壁生长,24h后进入对数生长期。
1.3 总RNA提取 取对数生长期GES-1细胞1×106加入1ml TRIZOL 试剂,匀浆后室温静置5min,加0.2ml氯仿涡漩振荡15s,室温放置2~3min。4℃、12000rpm离心15min,将上清液移至另一新管,加入0.5ml异丙醇混匀,室温放置10min,4℃、12000rpm离心10min,弃上清液,加75%乙醇(DEPC处理水配制)1ml,涡漩漂洗1次,4℃ 7500rpm离心5min,弃上清液,空气干燥15min,沉淀溶于0.01% DEPC-treated water,置55℃~60℃水浴中孵育10min,取少量用于RNA含量及纯度测定,其余分装后置-70℃冰箱保存。
1.4 cDNA的合成 用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链,反应体积10μl,反应体系中加入:总RNA2.0μg,Oligo(dT)15引物0.5μl,25mmol /L MgCl2 2.0μl,10mmol/L dNTP 1.0μl,10×buffer 1.0μl,RNase Inhibitor 0.25μl,AMV(25U/μl)0.6μl,ddH2O补足10.0μl,30℃孵育10min,42℃孵育30min ,99℃ 5min终止反应,5℃ 5min灭活反转录酶。-20℃冻存备用。
1.5 PCR扩增反应 反应体系如下:反转录产物1.0μl,25mmol /L MgCl2 0.5μl,10×buffer 2.5μl,引物各0.25μl,Taq酶(5U/μl)0.3μl,ddH2O补足25.0μl。PCR反应条件为:95℃预变性30s,然后按95℃ 30s、56℃ 30s、72℃30s进行35个循环,最后72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.6 DNA测序 PCR产物由大连宝生物公司测序。
2 结果
2.1 RT-PCR结果 PCR产物琼脂糖电泳结果为单一条带,大小约504bp,与预期相符(图1)。
2.2 DNA测序结果 经与GenBank比对,扩增产物序列与MYCT-1 cDNA序列完全相符。
3 讨论
MYCT-1基因主要分布于细胞核,可能与细胞信号转导有关。组织表达谱分析发现MYCT-1在各种正常组织中均有表达,而在胃癌、喉癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤表达下调,说明它对维持细胞的正常功能是必需的,可能是一个新的抑癌基因。利用细胞模型研究其功能是常用的方法之一。
图1 PCR扩增产物电泳结果
M:DL2000 marker 1:MYCT-1
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象,这一机制能够特异性地降低目的基因的表达,是生物体内普遍存在的生理现象。通过对这一现象的深入研究,利用体外合成双链RNA诱发RNA干扰,这一技术被不断完善,并广泛用于基因功能和基因治疗研究。在本研究中,选用人胃黏膜细胞系GES-1作为研究模型。GES-1细胞系可在体外长期稳定传代,且在裸鼠中不致瘤,已广泛用于离体癌变的研究。有无MYCT-1基因表达,是GES-1细胞能否作为研究模型的关键。用RT-PCR方法检测了培养细胞的MYCT-1表达水平,结果表明可以从细胞总RNA提取物中扩增出MYCT-1 cDNA片段,DNA测序证实扩增序列与GenBank报道的序列完全相同,证实GES-1细胞可以作为RNAi模型用于MYCT-1基因功能研究,为下一步工作奠定了基础。
【参考文献】
1 邱广斌, 贺光, 孙开来,等. 6q25区域一个新基因MYCT-1的克隆及特性分析. 中华医学遗传学杂志,2003, 20(2): 94-97.
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3 欧阳小明,黄世章,梅开勇. MTLC基因在乳腺癌组织中的表达及其意义. 中国煤炭工业医学杂志,2006, 9(7): 695-696.
4 刘水平, 贺剑鸣. MTLC 基因在肝细胞癌及其癌旁肝组织中的表达. 湘南学院学报(医学版) , 2006, 8(3): 16-17.
5 邱广斌, 郝冬梅, 宫立国, 等. MTLC基因在喉癌组织中的低表达及其对喉癌Hep2细胞凋亡的影响. 中华检验医学杂志,2005, 28(11): 1178-1180.