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【摘要】 胸腺来源的CD4+CD25+调节性T细胞在外周免疫耐受机制中发挥着重要作用。其表面表达多种分子标志，包括CD25(IL-2受体α链)、细胞毒T细胞相关抗原-4(CTLA-4)、肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR)和程序性死亡1(PD-1)、叉头翼螺旋转录因子(Foxp3)等膜分子。然而这些细胞表面分子均非调节性T细胞的特征性标志，不能据以区分调节性T细胞与活化的T细胞。寻找合适的表面分子标记物将是对调节性T细胞进行深入研究的关键步骤。本文就近年来关于CD4+调节性T细胞的分子标记物及作用机理的研究做一综述。
【关键词】 CD4+调节性T细胞;分子标记物;Foxp3
调节性T细胞(regulatory T cell，Tr)能够阻止针对自身抗原的炎症反应，并能限制自身免疫病的发展。这些具有免疫调节作用的细胞以两种形式存在，一种是体内自然存在的细胞，另一种是经诱导后产生的细胞。本文就近年来关于CD4+调节性T细胞的分子标记物及作用机理的研究做一综述。
1 CD4+调节性T细胞的起源
CD4+ CD25+ Tr细胞是目前研究较多的亚型，其他还有Th3和Tr1[1]。CD4+ CD25+ Tr细胞在自身免疫耐受中起重要作用，它来源于胸腺的CD4+CD25-T细胞。在胸腺的自然选择过程中，T淋巴细胞受体(TCR)与低密度的MHC-lI类肽复合物或胸腺内皮细胞递呈的外周自身肽间高亲和力的反应介导CD4+CD25+Tr细胞的分化发育。此外，最近发现当未成熟淋巴细胞在胸腺中经历选择时，对自身MHC/抗原肽分子亲和力较高的一群CD4+T细胞被“部分活化”，并获得其他一些特性，发育成为具有免疫抑制功能的CD4+CD25+Tr细胞，这种选择途径被称为“另类阴性选择”。Tr1与 Th3是另外两类比较常见的调节性T细胞。Tr1的主要特征是：分泌高水平的IL-10，低水平的IL-2，中度水平的TGF-β、IFN和IL-5。Th3区别于 Tr1主要在于其分泌高水平的TGF-β。需要指出的是,CD25分子不能将CD4+CD25+Tr细胞与Tr1、Th3细胞区别开来。前者组成性表达CD25，后者在T细胞活化后也表达CD25，但CD4+CD25+Tr细胞是源于胸腺的一个独特的T细胞亚群，而Tr1、Th3细胞则是在外周生成的。多数情况下，Trl、Th3是通过抗原反复刺激诱导产生的。在IL-10存在的条件下，慢性激活CD4+T细胞可诱导Trl的产生,口服IL-4及MBP可诱导Th3的产生。
2 CD4+调节性T细胞的分子标记物
CD4+CD25+Tr细胞表面表达多种分子标志，包括CD25(IL-2受体α链)、细胞毒T细胞相关抗原-4(CTLA-4)、肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR)和程序性死亡1(PD-1)等膜分子。然而这些细胞表面分子均非Tr的特征性标志，不能据以区分Tr与活化的T细胞。Hori等发现Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor 叉头翼螺旋转录因子)在CD4+CD25+调节性T细胞中特异性表达，且对该群细胞的发育和功能起重要作用。Foxp3可在一定程度上反映CD4+CD25+Tr的水平和活性[2]。但也有学者发现Foxp3表达并非CD4+CD25+ Treg的激活信号。活化的CD4+CD25+Tr不表达Foxp3。Foxp3不仅在CD4+CD25+T细胞表达，也在激活的CD4+CD25-T细胞、CD8+T细胞表达。在小鼠中Foxp3只特异性地表达于胸腺和外周血的CD4+CD25+ Tr，可作为CD4+ CD25+ Tr的一个特异性标志。然而人类的Foxp3除在CD4+CD25+Tr上表达外，在TCR刺激时，其他非调节性T细胞也表达，因此Foxp3在人类 CD4+CD25+Tr上的表达并不具有特异性，Foxp3表达的量并不一定代表 Tr的量[3]。与人类不同，小鼠的T细胞在TCR刺激时Foxp3表达并不增加，但在TGF-β存在时Foxp3表达增加，而且与调节功能相关的表面标志，如CD25、CTLA-4、GITR均表达[4]。Foxp3缺陷的小鼠缺乏调节性T细胞，导致免疫调节障碍和自身免疫紊乱。在人类X连锁的Foxp3基因的突变可以导致免疫调节缺陷、多种内分泌病和X连锁自身免疫综合征。Foxp3可以封闭Rel家族转录因子NF-AT和NF-κB的作用，诱导他们的靶基因，从而发挥IL-2的转录抑制子的作用[5，6]。序列分析发现在Foxp3位点上有3个高度保守的非编码区：Foxp3启动子区、TGF-β传感器区、调节性细胞特异性脱甲基作用区(TSDR)[7]。天然的调节性细胞和诱导的调节性细胞的TSDR的甲基化作用是不同的。天然的调节性细胞TSDA是完全的甲基化，而诱导的TSDR甲基化作用与活化的传统的T细胞类似[8，9]。关于人类Foxp3+CD4+T细胞的基因表达、表现型、抑制功能的研究结果不尽相同。近来Sakaguchi等人[10]对CD45RA和CD45RO进行了研究，发现CD45RA可以作为Foxp3lowT细胞的表达标志，而Foxp3+CD45RO+ T细胞属于效应性调节性T细胞，具有很强的抑制功能。最近的研究[11～13]表明miRNA对Tr抑制具有重要的调节作用。miR-155和miR-146a 在鼠的Foxp3依赖的Tr上高表达，刺激后在效应性T细胞和骨髓细胞上暂时上调。miR-155和miR-146a抑制细胞因子信号转导抑制剂(SOCS)1的表达，他对STAT1具有关键的阴性调节作用。miR-146a主要是控制Tr调控Th1应答的能力[14]。研究发现Foxp3不仅表达在T细胞上，在胰腺癌细胞上也发现Foxp3的mRNA和蛋白。在体内胰腺癌细胞是T细胞增殖的有效抑制剂。Foxp3表达的减少部分地逆转了胰腺癌细胞的抑制活性[15]。Moo-Young等人[16]把新鲜分离的CD4+CD25-效应性T细胞和胰腺癌细胞(Panc89,Colo357)共同培养，TCR诱导的扩增被抑制。但是目前还不知道这种抑制是由Foxp3+肿瘤细胞直接作用的，还是由于某些效应性T细胞转化成了Tr1或Th3间接作用的。也有报道[17]认为CDl27可以作为调节性T细胞的一个特异性标志，在CD25表达时，CDl27(IL-7受体的α链)可以区别Tr和活化T细胞。Tr应为CDl27低表达(CDl27low)，而活化的效应T细胞为CDl27高表达(CDl27high)。Liu等[18]运用微点阵基因表达谱技术发现，CD4+CD25+细胞表面CD127表达下调，而大部分CD4+Foxp3+T细胞表面均为CD127低表达，且体外具有抑制活性。近来有研究[19，20]表明GARP 或LRRC32可能是调节性T细胞的特异性活化标志。GARP是TCR反复刺激产生的一种Toll样受体。它被认为是人类CD4+CD25highFoxp3high调节功能的补充。调节性T细胞上si-RNA介导的GARP的下调导致了抑制能力的下降;而非调节性T细胞上的过分表达也能发挥类似于调节性T细胞的抑制功能，因此提示GARP在活化的调节性T细胞上发挥重要的功能[21～23]。
3 调节性T细胞的作用机制
尽管付出了很大的努力，但是调节性T细胞抑制效应性T细胞的作用机制还不十分明确，可能涉及抑制性细胞表面分子和抑制性细胞因子。
3.1 抑制性细胞表面分子的调节作用
Tr细胞发挥抑制作用是细胞因子非依赖的，而主要依赖于细胞间直接接触，并通过TCR来激活抑制性细胞。参与Tr细胞接触抑制的重要分子之一为该细胞表达的CTLA-4。Tr细胞活化后CTLA-4的表达增加，并持续表达。CTLA-4分子胞浆区可与磷酸酶SHP-1及SHIP结合，对CD4+及CD8+T细胞活化均有负调节作用。CTLA-4与B7配接后，其胞内段携带的ITIM传递抑制信号，抑制T细胞的增殖和活化。用抗CTLA-4单抗可阻断Tr细胞的抑制作用。调节性T细胞上表达的CTLA-4可以刺激树突状细胞表达吲哚2，3-双加氧酶(IDO)，分解色氨酸 [24]。但CTLA-4缺陷小鼠的Tr细胞也能发挥某种程度的抑制作用[25]。因此，CTLA-4在Tr细胞功能中的作用还需进一步研究。LAG-3是CD4相关的蛋白，在调节性T细胞上高表达。LAG-3与APCs上的MHC II类分子结合，从而减弱活化的效应性T细胞的功能。因此，APCs或DC在抑制效应性T细胞功能上发挥重要作用[26]。CD4+CD25+Tr细胞所表达的膜型TGF-β也可能是其介导免疫抑制功能的重要分子之一，这不同于Tr细胞产生的分泌型TGF-β。TGF-β隐性相关肽(LAP)在活化的调节性T细胞表面表达并发挥抑制分子的作用。LAP的表达需要GARP，他们在调节性T细胞表面相互结合。GARP作为LAP的转运子，把LAP带到免疫应答的部位，释放TGF-β。CD28分子也是参与接触抑制作用的分子之一，例如，加入抗CD28抗体不仅能明显加强CD4+CD25-T细胞的反应，还可几乎完全消除CD4+CD25+Tr细胞的抑制作用。此外，GITR(glucoconicoid-inducedTNFR)也参与接触抑制机制。GITR是TNF受体超家族成员之一，抗GITR单抗能阻断CD4+CD25+Tr细胞的抑制功能。
3.2 细胞因子的调节作用
Tr细胞分泌的两个重要的细胞因子为IL-10和TGF-β。其中以IL-10对效应性T细胞的抑制作用占主导，通过IL-10对效应性T细胞的抑制作用强于通过TGF-β。IL-10是CTL分化因子及B细胞活化因子，在天然免疫过程中是重要的负调节因子。它抑制巨噬细胞分泌TNF、IL-1、IL-6和趋化因子，抑制巨噬细胞对T细胞的辅助作用。IL-10基因敲除的小鼠易发生炎症性损伤，其原因之一可能在于巨噬细胞的激活失去了控制。IL-10可直接抑制IL-2的产生。CD25分子即为IL-2Rα链，CD25+T细胞介导抑制作用的机制之一就是被动地吸收由效应细胞产生的IL-2。有高浓度的IL-2存在时，Tr细胞可出现明显的经TCR介导的增殖反应。当其不依赖于TCR的刺激因素刺激时，Tr细胞的反应水平正常。IL-l0还具有抑制前炎症细胞因子的产生，抑制抗原特异性T细胞的激活，抑制单核细胞表达MHC-1I类抗原和辅助刺激分子，抑制单核细胞和巨噬细胞产生NO等功能。给予外源性IL-l0能够使双阴性Tr细胞对凋亡易感，并且使它们失去抑制功能。TGF-β在免疫调节与耐受中的重要性已经逐步被认识。TGF-β的作用主要有以下几方面：(1) TGF-β能够抑制包括T细胞、B细胞、巨噬细胞等在内的多种细胞，并且TGF-β产生量的增加与阻止自身免疫病的发展及自身免疫病的恢复有关;(2)TGF-β能与CTLA-4协同作用终止免疫反应;(3)Th0、Th1及Th2细胞亚群在与CTLA-4交叉连接的情况下都能分泌TGF-β;(4)Tr细胞分泌的TGF-β不仅能对效应细胞发挥抑制作用，也能对记忆性T细胞发挥抑制作用;(5)TGF-β可与其他抑制性分子一起作用，在免疫特赦部位维持一种稳定状态，在其他器官稳定状态的维持中可能也有重要作用;(6)TGF-β下调黏附分子，并且抑制白细胞向内皮细胞的黏附;(7)TGF-β还有一个明显的作用就是直接抑制IFN的产生。用TGF-β处理过的CD4+T细胞在葡萄球菌肠毒素(SEB)的刺激下，产生IFN的数量较之没有用TGF-β处理过的CD4+T细胞明显减少。此外，在实验中为了增加抗体的产生，需要在培养开始时加入抗TGF-β抗体，这表明TGF-β是调节早期T细胞的活性而不是B细胞的分化。大量Tr细胞产生的高水平的TGF-β能够抑制IgG的产生，少量Tr细胞产生的低水平的TGF-β只能在短距离以细胞接触的方式发挥抑制作用。另外，有研究表明IL-35(属于IL-12家族)主要由调节性T细胞产生。IL-35缺乏的调节性T细胞的抑制功能下降[27]。表达IL-2高亲和力受体α链的调节性T细胞可以和效应性T细胞产生的IL-2结合。细胞因子缺乏诱导的凋亡在调节性T细胞抑制免疫应答中也发挥重要作用[28]。高浓度的IL-2和IL-15可以完全消除调节性T细胞的免疫抑制作用，而IL-4和IL-7的结果不同。综上所述，CD4+调节性T细胞在正常人体稳态的维持，在肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及病毒感染等病理状态下都起着重要作用。因此，进一步深入研究CD4+调节性T细胞有重要意义，随着对Tr研究的深入，Tr也许会为人类疾病的治疗提供新的靶点。
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