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【摘要】 目的 观测阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000对人角膜基质细胞的影响，探索其应用于人角膜基质细胞的可行性及安全浓度范围，为人角膜基质细胞的基因治疗研究奠定基础。方法 体外培养人角膜基质细胞，取第3～5代细胞鉴定后用于实验。采用四氮唑盐代谢法（MTT），检测不同浓度和作用时间Lipofectamine TM 2000对培养的人角膜基质细胞增殖的影响;采用0.5%台盼兰染色法，检测脂质体Lipofectamine TM 2000对培养的人角膜基质细胞存活率的影响与其浓度和作用时间的关系。结果 阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000（LF2000）对人角膜基质细胞的影响与浓度和作用时间有关。LF2000在浓度高于一定水平时可以引起细胞增殖和存活率的下降，浓度相同时作用时间越长下降越明显。LF2000在浓度40μg/ml以下作用24h不会对细胞增殖和存活率产生影响。结论 Lipofectamine TM 2000在一定浓度范围内不引起细胞毒性。Lipofectamine TM 2000有望在人角膜基质细胞的基因治疗中发挥重要作用。
关键词 角膜基质细胞 基因转染 阳离子脂质体
角膜基质层占全角膜厚度的90%以上，角膜损伤后修复过程中基质细胞的变化，对视功能的恢复极为重要。临床医生一直在努力寻找调节角膜损伤愈合反应的药物，分子和细胞水平药物治疗是目前的研究热点。本实验试图通过利用不同浓度和作用时间阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000作用于体外培养人的角膜基质细胞，探索其浓度范围及作用时间，旨在为基因预防及治疗角膜疾病打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料 主要仪器:低温离心机，恒温箱，细胞培养箱，倒置相差显微镜，低速恒温离心机（Hereus公司）。主要试剂:脂质体Lipofectamine TM 2000（Gibco/BRL公司），DMEM培养基（Gibco/BRL公司）。
1.2 方法
1.2.1 人眼角膜基质细胞的原代培养及传代培养 采用组织块培养法，将组织碎块接种于培养瓶壁上，先置入37℃、5%CO 2 温箱中4h，待组织块贴壁微干涸后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基适量。培养瓶放入37℃、5%CO 2 温箱中培养3～5天换1次培养液。原代基质细胞80%汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。超净台内无菌条件下，先吸出培养瓶内旧培养液，用少量D-Hanks漂洗1次。加入0.25%胰蛋白酶少许，置温箱中3min。在倒置相差显微镜下见细胞胞质回缩成圆形，彼此分离并即将离壁，加入20%胎牛血清DMEM培养液终止消失。再加入适量培养基，用吸管吸取培养液轻轻反复吹打，使细胞脱离瓶壁，成为细胞悬液。按1:2分装细胞悬液后置温箱中培养，每3天换1次培养液。
1.2.2 细胞爬片的制备及鉴定 超净台内无菌条件下，将已消毒的盖玻片放入6孔培养板中，每孔2片。将第三代融合生长的基质细胞用0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液。将消化稀释的细胞悬液滴在盖玻片上，置入温箱中培养，常规定时换液;细胞生长至接近融合后，取出盖玻片，D-Hanks液漂洗后，置入固定液中固定。用第3～5代的人眼角膜基质细胞作成细胞爬片，至50%～60%汇合后取出。D-Hanks液冲洗2次后，置于4℃冷丙酮液中固定15min，D-Hanks冲洗后空气中自然干燥，置-20℃备用。PBS液洗5min×3次，Tritonx-100洗涤5min，再用PBS洗5min×3次。加0.3%H 2 O 2 /甲醇溶液于玻片上，置湿盒内室温下处理20min，PBS洗5min×3次。加正常血清于玻片上，置湿盒内室温下20min。小鼠抗人波形蛋白及角蛋白单克隆抗体工作液于玻片上，置湿盒内4℃过夜，PBS洗5min×3次。加生物素化羊抗鼠二抗于玻片上。置湿盒内37℃30min，PBS洗5min×3次。加入HRP（辣根素过氧化物）酶标记的链霉亲和素工作液，置湿盒内37℃30min，PBS洗5min×3次。AB/H 2 O 2 显色，流水充分洗。中性树胶封片，显微镜下观察。
1.2.3 Lipofectamine TM 2000对人角膜基质细胞的影响 MTT测定法观察Lipofectamine TM 2000对基质细胞增殖的影响:取第四代基质细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液。调整细胞浓度4×10 4 /ml接种到96孔板内，每孔加入100μl细胞悬液。培养24h，细胞贴壁后，吸去原培养液，各组分别加入浓度为0（阴性对照）、5、10、20、40、80μg/ml的Lipofectamine TM 2000，每孔100μl，继续置温箱培养。每组设复孔5孔，另设5孔空白对照。培养12h或24h后每孔加入5mg/ml MTT10μl，继续置入温箱中培养。培养4h后，吸走原液，每孔加入DMSO100μl，室温静置5min，摇匀后于酶联免疫检测仪检测各孔550nm波长处的吸光度值（A值）。计算公式为:增殖率=（Lipofectamine TM 2000组A值/阴性对照组A值）×100%。
台盼兰染色观察Lipofectamine TM 2000对基质细胞存活的影响:细胞接种、分组方法同MTT法。分别在加入Lipoˉfectamine TM 2000后12h及24h，每组取5孔，小心吸弃培养上清液，滴加一滴0.4%台盼兰溶液，立即在倒置相差显微镜下观察。死亡细胞因细胞膜完整性破坏，可被台盼兰染成兰色，而正常细胞染色阴性。分钟内分别计数每孔5个低倍视野中染色阳性和阴性细胞的数目，取平均值作为统计结果。细胞存活率计算公式:存活率=（台盼兰染色阴性细胞数/细胞总数）×100%。
1.3 统计学方法 应用SPSS软件包，采用t检验及方差分析进行均数间差异显著性比较。
2 结果
2.1 人角膜基质细胞的培养及鉴定 组织块接种后第3天，细胞从组织块边缘游离出来，单层，贴壁，细胞呈梭性，核圆，居中，细胞传代后，7天后细胞基本融合生长。细胞爬片行免疫组织化学染色后，在显微镜下可见细胞胞浆中均呈灰褐色阳性染色，即波形蛋白染色阳性，而角蛋白染色为阴性，证明所培养细胞确实为角膜基质细胞。
2.2 Lipofectamine TM 2000对人角膜基质细胞的影响
2.2.1 Lipofectamine TM 2000对人角膜基质细胞增殖和存活率的影响 （1）Lipofectamine TM 2000在浓度20μg/ml下作用24h，对人角膜基质细胞增殖和存活率没有明显影响，与阴性对照组均数比较差异无显著性（P>0.05）;在浓度40μg/ml以上作用24h，则引起细胞增殖和存活率的明显降低（P<0.05）。（2）Lipofectamine TM 2000在浓度40μg/ml或80μg/ml下作用24h比作用12h组细胞增殖和存活率高，差异有显著性（P<0.05）。（3）从表1、2，可以看出人角膜基质细胞增殖率和存活率随Lipofectamine TM 2000浓度的增高而呈下降的趋势。
表1 不同浓度LF2000对培养的基质细胞增殖率的影响 （略）
表2 不同浓度LF2000对培养的基质细胞存活率的影响 （略）
3 讨论
正常角膜基质由250层胶原纤维板构成，呈交错排列，每层纤维板又由许多平行排列、直径相同的胶原纤维组成。基质区的主要细胞成分为角膜基质细胞，它合成和分泌纤维，并且对其排列和平衡都起作用。角膜创伤和修复过程中基质细胞的变化，对角膜的结构和功能有重要的影响。
近年来，人们在研究和控制角膜创伤修复过程方面进行了相当大的努力，但是许多修复过程机制尚待进一步研究。随着分子生物技术的迅速发展，基因治疗作为一种全新的治疗手段已日益受到重视。基因转染技术作为基因治疗的基础，在眼科疾病的诊断和治疗的研究中也有广泛的应用前景 ［1～3］ 。其关键技术在于能使外源基因进入靶细胞的载体，一个理想的载体应具有能在适当的启动子控制下将目的基因转向特定的靶细胞或靶组织、不激发炎症反应或免疫反应、能够根据不同治疗需求短暂或长期在宿主体内表达、载体应易于构建和纯化、高滴度且不会引起插入突变或引发野生型病毒污染 ［4，5］ 。为基因治疗的载体通常包括有裸体DNA（也称质粒）、阳离子脂质体及病毒类等 ［6，7］ 。裸体DNA转染效率低，作为生物学方法有病毒载体介导的体内基因转染效率虽然较高，但由于病毒载体有免疫原性，运用于临床治疗有很大的风险性。脂质体属于非生物学方法没有类似病毒载体的安全性问题，方法简单、免疫原性弱、容量大，比较适用于体内基因治疗的途径，尤其是目前发现的多价阳离子脂质体转染效率较高 ［8，9］ 。从本实验可由脂质体Lipofectamine TM 2000在一定浓度范围及作用时间内，对人角膜基质细胞增殖和存活率没有明显影响，可以利用其将某些目的基因转入角膜基质细胞，从分子水平干预损伤后角膜修复过程，为治疗角膜疾病提供一种新的更为有效的方法。
参考文献
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