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【摘要】 目的 存活素基因异常表达可抑制半胱氨酸蛋白酶32（Caspase-3）介导的细胞凋亡。已往的研究发现丝裂霉素C（Mitomycin C，MMC）对Caspase-3的活化在诱导膀胱癌细胞凋亡中有重要作用，但不同的膀胱癌细胞系对MMC诱导凋亡的敏感性存在明显差异，这是否与存活素基因异常表达有关尚不清楚。针对存活素基因表达对MMC诱导膀胱癌细胞凋亡的影响进行研究，旨在探讨其作用。方法 在培养的膀胱癌细胞系EJ、BIU87中加入MMC（0.1mg/ml），于不同的时间点（12、24、36、48h），采用末端脱氧核苷酸转移酶介导生物素标记法（TUNEL）检测细胞凋亡、免疫细胞化染色检测Caspase-3蛋白表达;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对存活素基因表达进行检测。结果 在12、24、36、48h4个时间点EJ细胞的凋亡指数分别为（38.4±1.1）%、（60.9±1.3）%、（63.7±2.1）%、（67.4±0.8）%，Caspase-3蛋白表达分别为（35.6±4.17）%、（57.32±4.83）%、（61.49±5.48）%、（63.56±5.05）%，均明显高于BIU87细胞（9.8±2.3）%、（36.3±1.90）%、（50.9±3.20）%、（52.4±3.80）%、（9.31±1.76）%、（32.93±3.91）%、（34.69±4.69）%、（35.35±5.28）%;而EJ细胞中存活素基因表达则明显低于BIU87细胞。结论 存活素基因表达水平对膀胱癌细胞的存活和化疗抗性的产生有重要影响，阻断其表达可能是膀胱瘤治疗的新靶点。
关键词 膀胱肿瘤 癌 存活素 细胞凋亡
Effect of survivin expression on mitomycin-C induced apoptosis
of bladder caricinoma cells
Zhao Changlin，Shi Xingmin，Xu Huimian，et al.
Department of Urology，Affiliated Hospital of Medical college of Dalian Univ
ersity，Dalian116021.
【Abstract】 Objective Abnormal expression of survivin can inhibit caspase-3-mediated apoptosis.Previous study has shown that mitomycin C（MMC）can induce apoptosis of bladder cancer cells via activation of caspas-3.However，there is obvious difference in sensitivity to MMC of different bladder cancer cell lines;and its relationship with abnormal survivin expression has not been known.We therefore examined survivin expression in two bladder canˉcer cell lines（EJ and BIU87）and investigated its correlation with apoptotic susceptibility.Methods EJ and mBIU87cells were treated by0.1mg/ml MMC and examined at the times of12-hour，24-hour，36-hour and48-hour afˉter treatment.The pattern of cell death and the a poptotic index were determined using TUNEL assay and immunocytoˉchemical staini ng.Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to determine the expression of caspase-3and survivin.Results The apoptotic indexes of EJ cells were（38.4±1.1）%，（60.9±1.3）%，（63.7±2.1）%，and（67.4±0.8）%at the time points of12-，24-，36-，and48-hour，respectively.The correˉsponding caspase -3expression were（35.6±4.17）%，（57.32±4.83）%，（61.49±5.48）%，and（63.56±5.05）%，respectively.Whereas，the values of these two parameters in BIU87cells were（9.8±2.3）%，（36.3±1.9）%，（50.9±3.2）%，（52.4±3.8）%，and（9.31±1.76）%，（32.93±3.91）%，（34.69±4.69）%，（35.35±5.82）%，respectively.In contrast，the expression of survivin was lower in EJ cells than in BIU87cells.Conclusion Expression of survivin impacts the survival and resistance to chemotherapy of bladder cancer cell.Blockage of surˉvivin expression may be a potential approach for bladder cancer therapy.Key words bladder neoplasms carcinoma survivin apoptosis
存活素是最近发现的抗凋亡蛋白（inhibitors of apoptosis，物及分子遗传学研究室IAP）家族新成员，它存在于膀胱癌等肿瘤细胞中，其异常表达可直接抑制半胱氨酸蛋白酶32（caspase-3）介导的细胞凋亡 ［1～3］ 。我们在已往的研究 ［3］ 中发现丝裂霉素C（Mitoˉmycin C，MMC）对caspase-3的活化在诱导膀胱癌细胞凋亡中有重要作用，但不同的膀胱癌细胞系对MMC诱导凋亡的敏感性存在明显差异，这是否与存活素基因异常表达有关尚不清楚。为此，我们针对存活基因表达对MMC诱导膀胱癌细胞凋亡的影响进行研究，探讨其作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人膀胱癌细胞系EJ、BIU87由北京大学泌尿外科研究所提供，在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO 2 条件下培养。
1.2 细胞生长动力学和细胞形态学观察 采用盖玻片培养法 ［3］ 。分为EJ、BIU87两组，各设空白对照组。在相同条件下，用MMC（日本协和发酵工业公司）0.1mg/ml处理细胞1h后吸出药液，漂洗2次，换无药培养液，此时定为0h，继续培养48h，分别于0、12、24、36、48h取培养细胞的盖玻片，用于HE、TUNEL和免疫细胞化学染色，并收集细胞进行台盼蓝染色，选择血细胞计数器1个室5个大方格（视野），计数500个细胞。根据不排斥台盼蓝染料的细胞数计数活细胞。每组每个时间点均平行培养3瓶细胞，均重复实验3次，取平均值。
1.3 TUNEL检测凋亡细胞 按TUNEL试剂盒（德国BM产品）说明书进行TUNEL染色。细胞核呈棕黄色为凋亡细胞，计算细胞凋亡指数（Apoptotic index，AI） ［3］ 。用PBS代替末端转移酶作为阴性对照。
1.4 Caspase-3蛋白表达的检测 采用SP法 ［3］ 。Caspase-3鼠抗人单克隆抗体（Santa Cruz产品），以1:120稀释比例染色，阳性细胞胸浆呈棕黄色着染。应用医学真彩色图像处理系统进行分析，在高倍镜下（×400）随机观察5个视野，至少观察500个细胞，计数细胞总数和阳性细胞数，按（细胞总数/阳性细胞数）×100%计算阳性细胞染色阳性率（%）。判定标准:Caspase-3蛋白表达以细胞浆呈棕黄色着染>10%为阳性染色。实验重复3次，取平均值。用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5 PT-PCR检测存活素mRNA表达 按Tizol试剂盒（Gibco产品）说明提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA含量。采用MMLV逆转录酶（Gibco产品）逆转录成cDNA。
采用50μl扩增体系，以β肌动蛋白（β-actin）为内参照 ［4］ 。存活素引物序列（SurvivinPCR产物，188bp）:上游:5′-CCCTˉGCCTGGCAGCCCTTTC-3′，下游:5′-CTGGCTCCCAGCˉCTTCCA-3′，扩增片段为188bp。反应条件:94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环38次，最后72℃延伸5min，取PCR产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳、EB染色，紫外透射仪下观察照相。
1.6 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，方差分析，t检验。
2 结果
2.1 低剂量MMC不同作用时间对EJ、BIU87细胞生长及凋亡的影响 低剂量MMC（0.1mg/ml）不同作用时间对EJ、BIU87细胞生长及凋亡的影响见表1、2。
EJ细胞在MMC作用24h HE染色出现凋亡细胞，作用48h大多数EJ细胞凋亡。BIU87细胞则在MMC作用36h出现凋亡细胞，48h凋亡细胞增多，但不论是作用时效，还是细胞凋亡形态变化，都不如EJ细胞反应敏感。空白对照组细胞生长明显快于MMC组，细胞形态无变化。EJ和BIU87细胞对MMC诱导凋亡的敏感性差异有显著性，两组AI在MMC作用12、24h差异有非常显著性（P<0.01），在MMC作 用36、48h差异有显著性（P<0.05），见图1。
2.2 Caspase-3蛋白的表达 EJ和BIU87细胞在MMC作用的不同时间内均有Caspase-3蛋白表达，但两组细胞Caspse-3蛋白表达强度不同，在MMC作用12、24、36、48h的不同时间点EJ和BIU87细胞Caspase-3阳性表达情况见表3。
表1 MMC（0.1mg/ml）不同作用时间EJ、BIU细胞生长结果比较 （略）
表2 MMC（0.1mg/ml）不同作用时间EJ、BIU细胞凋亡指数结果比较 （略）
表3 存活素作用EJ、BIU细胞系Caspase-3 表达的结果比较 （略）
2.3 存活素mRNA表达 EJ及BIU87细胞均在188bp处出现特异性扩增片段条带，其不同的亮度代表不同的表达量，亮度以BIU87细胞为明显（图2）。内参照β-actin表达恒定、均等。
图2RT-PCR检测膀胱癌细胞存活素mRNA表达结果 略
3 讨论
存活素基因定位于17号染色体，DNA全长14.7kb，编码142个氨基酸，与IAP具有同源性，但与其它IAP蛋白不同，仅含一个杆状病毒LAP重复序号 ［1］ 。Swana等 ［5，6］研究发现膀胱癌、胃癌细胞中存活素基因异常表达可抑制肿瘤细胞凋亡，增强其存活能力。最近研究表明，存活素可在体外和体内实验中抑制各种凋亡信号诱导的细胞凋亡 ［7］ ，但存活素对化疗药物诱导肿瘤的影响尚不清楚。
大量的研究显示诱导肿瘤细胞凋亡是许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长的主要机制 ［8］，其抑癌作用是通过活化Caspase-3诱导细胞凋亡实现的 ［3］ ，但因不同肿瘤细胞的凋亡阈值不同，致使不同肿瘤细胞对化疗药物诱导凋亡的敏感性亦不同 ［9］ 。本研究发现EJ和BIU87细胞对MMC诱导凋亡的敏感性差异有显著性，主要表现:（1）活细胞数量:在MMC作用下EJ活细胞数量少，而BIU87活细胞数量较多;（2）AI:在MMC作用下BIU87细胞AI明显低于EJ细胞;（3）作用明显:与EJ细胞相比，BIU87细胞生长受抑制滞后，凋亡发生迟缓。结果提示不同的膀胱癌细胞系，及至不同个体的膀胱癌患者间对化疗药物诱导凋亡的反应存在差异。推测其原因除受肿瘤遗传学和肿瘤细胞异质性的影响外，存活素基因表达水平的高低对于癌细胞的存活或癌细胞的化疗抗性有较为重要的影响。Tamm等 ［10］ 发现存活素是效应性Caspase的直接抑制剂，该基因表达增强可直接抑制Caspase-3活化，进而抑制Ca