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Huang Yuxiang，Zhang Jincan
Chao Zhou Central Hospital，Guang Dong Province，Chaozhou521000.
【Abstract】 Objective To evaluate the diagnostic value of the methods of selecting tubercle bacillus（TB）by polymerase chain reaction（PCR），routine culture，method of direct smear and concentration smear.Methods To deˉtect TB in sputum by four kinds of methods.Results In the detection TB in148samples of sputum，the positive rate of PCR is25.7%;routine culture:5.6%;direct smear:3.5%and concentration smear:10.5%.Conclusion The method of PCR is shorter and more sensitiv
e than the other ones.The positive rate of concentration smear is higher than the one of direct smear.
Key words sputum PCR TB
伴随着经济发展，生活水平提高。健康已受到人们的普遍的重视。然而近几年肺结核病发病率呈上升趋势，此病越来越受到人们的关注，一方面，肺结核病严重威胁患者的健康，“是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病;” ［1］ 另一方面，肺结核病具有强传染性，通过呼吸道传播。因此，患者如果没有及早得到确诊，一方面会危及患者生命;另一方面又会感染周围的人。“在我国结核病是国家重点控制的传染病，但结核病的疫情依然相当严重。部分地区有蔓延趋势。结核病的患者人数在世界各国中居于第二位。” ［1］ 面对这样一个严峻的客观情况，找到一种准确、快速的结核病检查方法是必需的。本文将对4种常用的结核病检查方法作一比较，以期为提供一个有效的参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 本院肺结核科及门诊肺结核142例，非肺结核肺部疾病48例。痰液均用一次性无菌平皿，取自病人晨起漱口后深咳1～2口痰，严格确保不混入唾沫。严格选用带有血丝及镜下有大量上皮细胞的涂片。
1.1.2 试剂与仪器 胰酶，选自上海长征化学试剂公司。2%NaOH、CaCl 2 自配。PCR试剂盒，为华美生物工程公司生产的配套试剂盒，含DNA提取液及阴、阳性对照。DNA扩增仪，北京新技术应用研究所生产的1109-Z型DNA扩增仪等。
1.2 方法
1.2.1 胰酶消化液配制 称取5g胰酶溶于100ml蒸馏水（5%），用2%NaOH调至pH8.0，加25mmol/L CaCl 2 1ml混匀后成一悬液。4℃冰箱保存，用前恢复至室温。
1.2.2 痰标本消化处理 应初步估计痰标本量，加入等量混匀的胰酶悬液，用干净竹扦搅动痰液，使二者充分溶解混匀。静置25～40min，吸取0.5ml加入离心管中，10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀加生理盐水1ml。振荡洗涤沉淀后10000r/min离心5min，如此3～4次，弃上清液，沉淀用做TB-DNA提取，剩余消化痰液倒入离心管再行10000r/min离心5min，吸去上清液，取沉渣涂片作抗酸染色。
1.2.3 TB-DNA提取沉淀物中加试剂盒所配DNA 提取液50μl振荡混匀，沸水浴10min，10000r/min，离心5min，上清液用于DNA扩增。
1.2.4 DNA扩增 取上清液2μl加入DNA扩增管中，5000r/min，离心数秒，上机扩增，扩增参数90℃120s预变性。然后按93℃45s、55℃120s先进行10个循环测定，再看结果。阴阳性判断根据试剂盒中说明书。
2 结果
2.1 同142例肺结核痰标本分别采用 痰液聚合酶链反应法（PCR）、痰液直接涂片镜检法、痰液浓集涂片镜检法、痰液常规培养法，培养检测结果，见表1。
表1 痰液中4种检查方法的结果比较 略
2.2 痰液中4种检查结果比较 对48例非肺结核病患者，采用4种不同方法进行痰液检测，结果结核杆菌试验均显示为阴性，见表2。
表2 痰液中4种检查方法的结果比较 略
3 讨论
结核病与人体的免疫功能有关，它主要是细胞免疫。免疫作用的主要表现是淋巴细胞的致敏和细胞吞噬作用的增强。当人体再次受到结核菌感染后，被结核菌致敏了的T淋巴细胞即释放出一系列淋巴因子，激活吞噬细胞，使其聚集在细菌周围，吞噬和杀死细菌，并变为类上皮细胞的郎罕细胞，形成结核结节，使病变局限化。
肺结核病是严重危害人体健康的慢性传染病，在人体抵抗力下降的情况下，因感染结核杆菌而发病。这与经济、生活、环境卫生等条件有关。肺结核特别是开放性肺结核病人的带菌痰液，是传染结核病的重要来源。其传染途径主要是呼吸道。病人随地吐痰，含菌的痰干燥后结核菌随尘埃在空气中飞扬，使健康人感染。由于危害性较大，在医学界引起高度重视。检查痰液中是否含有结核杆菌，是临床诊断或鉴别肺结核与其他肺部疾病的重要依据。痰液中结核杆菌的检查方法，通常采用常规痰涂片及痰培养。随着现代科技的发展，近年来，
结核病的分子生物学诊断技术在医学领域取得飞速发展，其中聚合酶链反应因其技术成熟，已应用于临床。
结核菌是一种分支杆菌。具有抗酸性，在临床常用的检查方法有:（1）痰液涂片镜检法:是各级医院检验科的临床实验室都在使用的常规抗酸性杆菌检查法。其特点是简便、快速和价格便宜，但敏感度低，造成一部分病人漏检。本室曾使用碱消化及汽油漂浮法进行浓集涂片，虽然阳性率提高，但因操作复杂及污染较大而被淘汰。有学者报道用N-乙酰-L-半胱氨酸或苏糖醇进行痰的前处理，取得较好结果 ［3］ 。只是成本较高，在临床难以推广。本文通过胰酶消化法进行浓集，使涂片阳性率提高，经PCR检测结果没有假阳性。而且成本低、操作简便，在临床实际工作中易于推广;（2）痰液结核菌常规培养法:是最可靠的方法，被誉为“黄金标准”;缺点是时间一般需要2～8周才能得出结果，影响病人的治疗时间，而且敏感度低。但培养法的优点是，其药敏实验结果，能为临床用药及细菌耐药性等方面提供准确有效的重要参考;（3）聚合酶链反应（PCR）:是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术，是生物医学领域中备受关注的焦点。这种方法反应灵敏、特异性高、高效快速。它的这些优势是涂片法及培养法所难以达到的。阳性检出率可达25.7%，明显高于其它方法。在临床应用中非常受欢迎。本文严格操作规范，克服了污染问题，48例非结核病人痰液检查聚合酶链反应结果全部呈阴性。这与AL Zahranik等报道基本相同 ［4］ 。但是，由于聚合酶链反应法对实验条件要求很高，操作过程很严格，否则容易造成假阳性，影响结果的准确性，误导医生作出诊断。
本文通过实验证明，无论采用哪一种方法对痰液进行结核杆菌检查，结果的准确性，都明显地受到标本收集及前处理质量的影响。在实验过程中要严格操作规范，才能确保结果的准确。通过各种方法的实验比较，各有其优缺点。因此笔者建议，在条件允许的情况下，痰液结核菌检查最好多种方法同时进行，以作相互修正，这样方可确保检出结果客观准确，为治疗用药提供有效的参考。
参考文献
1 王苏民.结核病及其实验技术的现状与展望.中华检验医学杂志，2001，24，71-72.
2 娄峥，吕纯凯.影响结核分枝杆菌涂片镜检和培养的几项重要因素.上海医学检验杂志，2000，15（1）:60-61.
3 AL Zahranik，AL Jahdalih，Porierl，et al.Accuracy and utility of comˉmereially available amplificatiaon and ser-liongic tests for the diagnosis of minimal pulmonary tuber-culosis.AMJRespir care Med，2000，163:1323-1329.
作者单位:521000广东省潮州市中心医院