点击显示 收起
关键词 鼻咽肿瘤 肿瘤转移 肿瘤浸润 细胞粘附 基质金属蛋白酶 口虾蛄
Gu Dishui，Kong Xia，Huang Peichun
Department of Pathophysiology，Guangdong Medical College，Zhanjian524023.
【Abstract】 Objective To study the effect of the extract of oratosquilla on the correlative factors of metastasis of human nasopharyngeal carcinoma cell line（CNE-2Z）and its mechanisms.Methods The effects of the drug on the potential of cell adhesion，migration and invasiveness of CNE-2Z were studied with cell-matrix adhesion assay，cell migration assay and matrigel invasion assay.Gelatin zymographywas adopted to study the effects of the drug on the secretion of gelatinase B（MMP-9）of CNE-2Z.Results The result of the cell-matrix adhesion assay indicated that the extract of oratosquilla could reduce the migration and invasiveness potential of CNE-2Z by dose-response fashion in vitro.At the same time the drug also could inhibit the secretion of gelatinase B（MMP-9）of CNE-2Z，but there was little effect of the drug on the potential of cell adhesion of CNE-2Z.Conclusion The extract of oratosquilˉla could reduce the migration and invasiveness potential of CNE-2Z by inhibiting the secretion of gelatinase B（MMP-9）.
Key words nasopharyngeal neoplasm neoplasm metastasis neoplasm invasiveness cell adhesion matrix metalloproteinase oratosquilla
口虾蛄（Oratosquilla），又称濑尿虾，属于节肢动物门，全世界目前已记录约350种。但有关口虾蛄的药用报道甚少。本研究室以前的工作发现口虾蛄提取物能抑制人低分化鼻咽癌细胞系的生长 ［1］ 。值得进一步探讨。
1 材料与方法
1.1 细胞系 CNE-2Z为人低分化鳞状鼻咽癌细胞系（广东医学院肿瘤研究所提供）。
1.2 主要试剂及仪器 5-FU（上海旭东海普药业），十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺及甲叉双丙（北京鼎国），96孔培养板及24孔培养板（Coster，华粤），Matrigel ○ R （Becton Dickˉinson Labware，USA），Human Fibronctin（Becton Dickinson Bioˉsciences，USA），Transwell ○ R （6.5mm Diameter，8.0μm Pore Size，Corning Coster Corporation，USA）。
1.3 方法
1.3.1 口虾蛄有效成分提取与配制 新鲜口虾蛄购于广东湛江港口，暴晒干后用高效粉碎机粉碎成粉未并称重。然后以95%乙醇浸泡3次，每次泡3天，每次浸泡液用滤纸过滤混匀后用旋转蒸发器在56℃下蒸发提纯。提纯物呈膏状，每克药物相当于生药3.81g。提取物用二甲基亚砜（DMSO）配成1000g/L，分装于4℃保存，临用时用培养液稀释成所需浓度，并使各组所含DMSO相同。
1.3.2 细胞-基质粘附试验 该实验方法见参考文献 ［2，3］ 。将Matrigel按2.0μg/孔（50μl）分别铺于96孔培养板中，放于超净台中风干过夜。选生长良好的细胞，常规消化吹打，计数，以每孔4×10 4 /100μl种在铺胶的96孔培养板中，并加入不同浓度的药物，每组设12个平行孔，于5%CO 2 ，37℃的细胞培养箱内孵育8h。取出96孔培养板，倒去生长液，加入结晶紫100μl/孔，染色10min，PBS洗涤3次×5min。每孔加入醋酸乙醇100μl/孔，用酶标仪测定A570nm值。实验重复2次，结果相似。
1.3.3 体外侵袭及运动试验 该实验方法见参考文献 ［2，3］ 。transwell上室腔内加入50μl稀释好的Matrigel（10μg），放于超净台中风干过夜。24孔培养板内加入10μg/ml纤维粘连蛋白的完全生长液（600μl/孔）。收集对数生长期的细胞，用含1%牛血清白蛋白的RPMI1640制成1×10 6 /ml的细胞悬液。以100μl/室加入到transwell小室内，同时加入不同浓度药物，每组设平行小室3个，将小室浸于24孔板的条件培养基中，5%CO 2 ，37℃温育24h。取transwell小室，甲醇:丙酮（1∶1），固定10min后，用棉签小心擦去未穿膜的细胞，HE染色，封片。在200倍光学显微镜下随机选择5个视野，计数每个视野细胞数目，取均值。运动试验除不铺Matrigel外，其余步骤相同。
1.3.4 明胶酶谱法 该实验方法见参考文献 ［2］ 。（1）取对数生长期CNE-2Z细胞以1×10 6 个/瓶种于75cm 2 培养瓶中，培养过夜。（2）次日，换无血清RPMI1640培养液培养1h。（3）去培养基，换含不同浓度药物的无血清RPMI-1640培养液2ml，于37℃，5%CO 2 培养箱中继续培养24h。（4）配制12%分离胶及5%浓缩胶，分离胶中加入以终浓度为0.1%的明胶，灌胶及以后电泳操作与普通SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相同。（5）收集各组培养上清液，低速离心（200×g）去除细胞碎片，上清液于-20℃贮存。同时将各瓶细胞消化，计数。（6）按照活细胞数取相应体积的培养上清液（约80～100μl）与1/2体积的样品缓冲液混合上样。4℃恒温电泳，开始以8V/cm电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶，然后将电压加至10V/cm，当溴酚蓝前沿离凝胶前端约2cm时，停止电泳（约4h）。（7）剥胶，漂洗后，移入100ml2.5%TritonX-100溶液中，在摇床上低速摇动以洗脱SDS（室温）。半小时后，换新的2.5%Triton-100溶液，继续洗脱1h。漂洗后，加100m1明胶酶缓冲液（50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L CaCl 2 ，200mmol/L NaCl，1μmol/L ZnCl 2 ，pH7.5）在37℃温育24h。（8）将凝胶漂洗后放入染色液中（0.1%R-250，甲醇:水:冰醋酸=45:45:10）染色4h，漂洗后，在脱色液（甲醇:水:冰醋酸=3:6:1）中脱色1～2h，至对照出现清晰负染酶带。（9）观察，照相，用LEICA Qwin图像分析软件对条带定量分析。
2 结果
2.1 细胞-基质粘附试验结果 CNE-2Z细胞在不同浓度药物作用8h后，实验药物组OD值变化不大。溶剂对照组、200.0mg/L、400.0mg/L、800.0mg/L组OD值分别为（1.313±0.073）、（1.320±0.058）、（1.304±0.052）及（1.306±0.085）。组间差异无显著性（F=0.141，P=0.935），与对照组相比，各组差异均无显著性（P>0.05）。但5-FU组（40.0mg/L）OD值（0.486±0.085）明显下降，与对照组相比，差异具有显著性（t=25.504，P=0.000）。
2.2 运动试验结果 随实验药物浓度的增高，穿PVPF膜的细胞数逐渐减少，呈明显的量效关系。溶剂对照组、200.0mg/L、400.0mg/L、800.0mg/L组穿膜细胞数分别为（84.67±5.15）、（36.07±5.46）、（31.00±2.60）及（15.60±2.16）。组间差异有显著性（F=157.574，P=0.000），与对照组比较，各组差异均有非常显著性（P<0.01）。但5-FU组（40.0mg/L）穿过PVPF膜的CNE-2Z细胞数（97.80±6.10）反而有增加趋势，与对照组相比，差异有显著性（t=-02.848，P=0.047）。
2.3 侵袭试验结果 随药物浓度的增高，穿PVPF膜的细胞数有下降的趋势，呈量效关系。溶剂对照组、200.0mg/L、400.0mg/L、800.0mg/L及5-FU（40.0mg/L）组侵袭细胞数分别为102.27±3.91、54.82±4.39、45.60±2.03、38.47±2. 48及64.80±4.98。实验药物组间差异有显著性（F=221.675，P=0.000），与溶剂对照组比较，各组差异均有非常显著性（P<0.01）。
2.4 明胶酶谱法结果 结果显示在凝胶深蓝色背景下92kD处有一条白色透亮负染带，即为明胶酶B（MMP-9），其负染程度随着药物浓度的增高亦有下降的趋势（见图1）。而在72kD处未见负染带。经反相处理后用EICA Qwin图像分析软件对条带进行定量分析，以面积乘灰度比代表明胶酶分泌量，结果显示溶剂对照组、200.0mg/L、400.0mg/L、800.0mg/L及5-FU（40.0mg/L）组明胶酶B分泌量分别为（4.4844±0.0256）、（2.5634±0.0720）、（0.9586±0.0371）、（1.2966±0.0437）及（0.5676±0.0187），实验药物组间差异有显著性（F=3350.487，P=0.000），与溶剂对照组比较，各组差异均有非常显著性（P<0.01）。
图1明胶酶谱法结果（数码相片）（略）
3 讨论
鼻咽癌是我国南方常见恶性肿瘤之一，常早期发生转移。在恶性肿瘤侵袭和转移过程中，癌细胞相互之间及其与正常细胞间的粘附作用、细胞外基质的降解和癌细胞运动游走能力起着重要作用，是决定恶性肿瘤能否发生侵袭转移的三个关键因素 ［4］ 。因此，可以通过观察药物对肿瘤细胞粘附力、侵袭能力以及运动能力的影响来判断其是否具有抗侵袭及抗转移作用。本实验结果显示药物浓度在200.0mg/L以上时对CNE-2Z细胞运动能力及侵袭能力均有明显的抑制作用，呈明显的量效关系，在800.0mg/L时药物对CNE-2Z细胞运动及侵袭的抑制率达81.6%及62.4%。而细胞-基质粘附试验结果显示不同浓度药物组OD值变化不大，提示药物对CNE-2Z细胞异质粘附能力无抑制作用。这些结果表明了药物可能具有抗侵袭作用。
进一步明胶酶谱法结果显示随药物浓度增高CNE-2Z细胞明胶酶B（MMP-9）分泌呈下降趋势，差异有非常显著性（P<0.01）。这说明了药物能抑制CNE-2Z细胞明胶酶B的分泌。基质金属蛋白酶是降解细胞外基质最重要的酶类，其中Ⅳ型胶原酶（明胶酶）有两种:72kD型和92kD型Ⅳ型胶原酶，即MMP-2及MMP-9，它们能够有效地分解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原蛋白，两者的过度表达与多种恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关 ［5］ 。研究表明MMP-9和MMP-2亦与鼻咽癌侵袭和转移密切相关，尤其MMP-9可能起主要作用 ［6，7］ 。还有人发现EB病毒潜伏膜蛋白（LMP-1）能够诱导鼻咽癌细胞中MMP-9的表达，同时也促进鼻咽癌细胞的异质粘附能力、运动能力及侵袭能力 ［3，8］ 。本实验中明胶酶B（MMP-9）负染带清晰可见，而各组明胶酶A（MMP-2）负染带均未出现，这更证实了MMP-9在鼻咽癌侵袭转移中的重要地位。从而也说明药物可能是通过抑制明胶酶B（MMP-9）的分泌而降低CNE-2Z细胞运动能力及侵袭能力，具有抗侵袭活性。
综上所述，口虾蛄提取物为粗提物，其中可能含某种抗侵袭转移活性成分，该活性成分能以MMP-9为靶点而发挥作用。进一步对其提纯及研究具有重要意义。
参考文献
1 赵明伦，罗晨美，龙发，等.人低分化鼻咽癌上皮细胞系生长能力检测和对中草药及海洋药物的反应.中华肿瘤杂志，1988，10（2）:93.
2 韩锐.抗癌药物研究与实验技术.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997，353-362.
3 Gou XM，Chen XY，Arrand JR，et al.Effects of Epstein-Barr virus laˉtent membrane protein1（EBV-LMP1）on related factors of metastasis of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE1.Ai Zheng，2003，22（5）:481-485.
4 John TP，Erik WT.Mechanisms of tumor invasion and metastasis:emergˉing targets for therapy.Expert Opin Ther Targets，2002，6（2）:217-233.
5 Philippe E，Van DS，B n dicte D，et al.Biochemistry and Molecular Biˉology of elatinase Bor MatrixMetalloproteinase-9（MMP-9）.Critiˉcal Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，2002，37（6）:375-536.
6 Zhang XX，Guo Y，Ye Q，et al.Study of the relation between MMP2，MMP9and nasopharyngeal carciooma.Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi，1999，13（8）:356-358.
7 苏勇，吴秋良，夏云飞，等.CD44V6和MMP-2在鼻咽癌组织中的表达及意义.广东医学，2002，23（5）:466-468.
8 Horikawa T，Yoshizaki T，Sheen TS，et al.Association of latent memˉbrane protein1and matrix metalloproteinase9with metastasis in naˉsopharyngeal carcinoma.Cancer，2000，89:715-723.
作者单位:524023湛江广东医学院病生教研室